[发明专利]用于鉴定一类新的水稻黄色斑驳病毒抗性基因和主要病毒抗性基因的基因座的手段及其应用

说明书

本发明涉及用于鉴定一类新的水稻黄色斑驳病毒(Rice YellowMottle Virus，RYMV)抗性基因和主要病毒抗性基因的基因座的手段、工具、和方法。

关于工具，本发明特别涉及感染周期所必需的蛋白质，标记和PCR引物，以及它们在抗性基因的物理作图和基因克隆中的应用。

RYMV是非洲的地方性病毒。它与其它南方菜豆花叶病毒组具有共同特征：即只有一条单链RNA，正极性、未聚腺苷酸化、且小型；并在植物中以非常大的数量产生T＝3对称的二十面体颗粒。病毒颗粒还大量存在于维管组织中，主要是导管。在Oryza glaberrima的少数稀有品种中，鉴定了针对RYMV的非常高的抗性。但是，由于这两种栽培稻物种之间的种间杂种极端不育，因此先前的研究尚不能够描述这种抗性的遗传基础或机制。

本发明人在这一领域的研究显示，称为Gigante的品种显示与O.glaberrima相同的特征，前者起源自莫桑比克，由ADRAO鉴定，且是Oryzasativa的成员。发明人通过证明RYMV抗性与考虑中的两种抗性来源(O.sativa和O.glaberrima)中相同的主要隐性抗性基因有关而表征了RYMV抗性。

该抗性以细胞-细胞运动的水平存在，并导致在受感染细胞处阻断病毒，而病毒复制是正常的。

发明人关于RYMV的工作显示，该病毒在整个感染周期中以不同方式运动和增殖。在接种叶片中(I，图11)，它是病毒RNA与病毒蛋白质(衣壳蛋白，P1，可能还有P3)复合物的形式，穿过表皮细胞、叶肉细胞、维管周围鞘细胞(束内输导组织和鞘细胞)的胞间连丝，到达维管细胞(韧皮和木薄壁组织)(II，图11)，局部运动。在维管细胞中，在所谓的长距离运动前，它在酸性pH的液泡中借助Ca²⁺二价离子包裹自身并稳定于致密颗粒的形式(II，图11)。只有在产生大量稳定颗粒时才发生全身感染。在全身感染叶片中，病毒离开输导组织，或在初期维管组织中或在叶肉细胞中增殖。在这一感染阶段，局部运动以去被膜形式(病毒RNA与蛋白质复合物)或被膜形式发生，但总是穿过胞间连丝(III，图11)。

在感染周期的这些不同阶段，病毒复合物和/或病毒粒需要由植物蛋白质鉴定并转运，从而由一个细胞区室运动至另一个细胞区室，由一个细胞运动至另一个细胞。

例如，与病毒或其复合物转运有关的植物蛋白质似乎具有相似功能(转运)，但是对于穿越的组织而言是特异的(表皮、叶肉、束内输导组织、维管周围鞘、韧皮部、木质部)。若这些蛋白质是由野生型等位基因翻译的，则它就是使病毒得以运动的易感蛋白质。另一方面，静默型等位基因似乎导致低功能的蛋白质(部分抗性)或无功能的蛋白质(完全抗性)。

由此认为，这些蛋白质属于其共同细胞功能显然是识别底物并转运通过胞间连丝的基因家族，但是这些蛋白质在组织特异性方面是不同的(表皮、叶肉、束内输导组织、维管周围鞘、韧皮部、木质部)。

共质体转运的调控极可能是这一基因家族的必需功能。

RYMV还是一种非常稳定的病毒，在细胞中存在几种异构体，已经确定了3种：致密型、肿胀型、和中间型。因此，颗粒的构造和外部电荷随细胞pH(细胞质pH7-8；液泡、小泡、和导管pH4.5-6.5)而变化。外部电荷使之得以附着于膜上并经内吞机制进入健康细胞。最后，在细胞水平，本发明人显示这种病毒主要在液泡中积累。因此，在部分抗性植株中3种异构体的在植物中的存在、区室化、和病毒积累有可能提出与抗性不同的RYMV耐受性原始机制。

RYMV耐受性似乎通过液泡中的积累而发生。通过物理隔离病毒颗粒与细胞区室，液泡膜显然防止了对细胞机器的任何有害的相互作用。因此，病毒增殖，积累，而并不杀死细胞(因此无症状)。

宿主细胞与病毒之间的关系是植物担当贮藏工厂。

在这种模型中，病毒与宿主植物之间的共进化引导病毒调整自身，最终由植物识别成由植物产生的简单贮藏蛋白质，经内质网和高尔基体转运至液泡。液泡膜的剧烈内陷(自噬机制)可能使在细胞质中产生的病毒得以在液泡中积累。

另外，这种机制还类似于细胞解毒，例如重金属或盐。

考虑到这些结果，发明人首先准备了用于鉴定识别并靶向转运植物中致病病毒所涉及的蛋白质和用于克隆这些过程所涉及的基因的方法。

因此，本发明的目的是提供用于捕获致病病毒(尤其是RYMV病毒)感染周期不可缺少的靶蛋白的方法，并涉及如此分离的蛋白质。

本发明的另一个目的是提供用于鉴定RYMV抗性基因座分子标记的方法。