[发明专利]转化真菌的新方法及其用于异源蛋白质生产的用途

权利要求书

1.一种重组的酱油曲霉，其包含一个导入的乙酰胺酶S(amdS)基因作为选择标记。

2.权利要求1的酱油曲霉，所述酱油曲霉在包含导入的amdS的底物作为唯一氮源的培养基上可选择，所述培养基还包含碳源，且没有内源性amdS诱导底物。

3.权利要求1或2的酱油曲霉，其中氮源是丙烯酰胺。

4.前述任一权利要求的酱油曲霉，其中酱油曲霉没有活性内源性amdS基因，例如因为内源性amdS基因包含内源性amdS失活突变，例如缺失或破坏。

5.一种将核酸序列导入酱油曲霉的方法，所述方法包括根据已知的将核酸序列导入真菌的方法，将核酸序列导入酱油曲霉中，例如通过转化或转染，所述方法包括将amdS基因作为核酸序列(此后称为导入的amdS基因)导入，随后在无内源性amdS诱导底物的培养基上选择所得的转化或转染的酱油曲霉，所述培养基还包含作为唯一氮源的导入的amdS的底物，并还包含碳底物，所述培养基能使包含所述核酸序列的所需酱油曲霉生长，同时消除无所述导入核酸序列的酱油曲霉的生长，因为这种酱油曲霉不导入amdS基因在选择培养基上没有生长能力，所述培养基还包含作为唯一氮源的除乙酰胺外的amdS的底物，例如作为导入的amdS的底物的丙烯酰胺。

6.一种通过权利要求5的方法获得的酱油曲霉。

7.一种选择转化或转染的酱油曲霉的方法，所述方法包括将权利要求1-4和6任一项的酱油曲霉，根据已知用核酸转化或转染真菌的方法转化或转染，所述方法包括将amdS基因作为核酸序列导入，随后在培养基上选择转化或转染的酱油曲霉，所述培养基包含导入的amdS的底物作为唯一氮源，还包含碳底物，所述培养基能使所需的酱油曲霉生长，同时消除未转化或未转染的酱油曲霉的生长，因为这种酱油曲霉不导入amdS基因在选择培养基上没有生长能力。

8.一种生产重组酱油曲霉的方法，所述方法包括将一种核酸序列以已知方式例如通过转化或转染导入权利要求1-4和6任一项的酱油曲霉中，所述核酸序列包含欲导入的所需序列及其侧翼的长度和同源性足以保证重组的内源性amdS基因片段或相应序列，从而同时消除内源性amdS基因，并导入所需序列，随后选择具有所需序列的重组酱油曲霉，这是通过选择包含在所需序列中或与所需序列共转化的选择标记而进行，所述选择标记在导入核酸序列之前的酱油曲霉中不存在，合适的选择标记是pyrG。

9.一种能在包含尿嘧啶和氟乳清酸的培养基上生长的酱油曲霉，所述酱油曲霉在包含尿苷和氟乳清酸的培养基上不生长，即所述酱油曲霉呈尿嘧啶辅源营养，所述酱油曲霉不能利用尿苷，所述酱油曲霉是pyrG阴性的，所述酱油曲霉对氟乳清酸有抗性，所述尿嘧啶辅源营养和氟乳清酸抗性可通过导入的活性pyrG基因的互补作用而减轻，合适地，所述酱油曲霉没有活性的内源性pyrG基因；例如酱油曲霉内源性pyrG基因在基因或基因调节序列中包含插入，取代或缺失形式的突变，例如缺失整个基因编码序列。

10.权利要求9的酱油曲霉，其组合权利要求1-4和6任一项的酱油曲霉的特性。

11.一种选择转化或转染的酱油曲霉的方法，所述方法包括将权利要求9或10的酱油曲霉用核酸序列转化或转染，所述方法包括将活性的pyrG基因根据已知转化或转染真菌的方式，导入酱油曲霉中，随后在不含尿嘧啶和氟乳清酸培养基上选择所得转化或转染的酱油曲霉，所述培养基至少还包含酱油曲霉生长所必需的基本底物，所述培养基能使所需酱油曲霉生长，同时消除未转化或未转染的酱油曲霉生长，因为这种酱油曲霉由于pyrG基因失活而无尿嘧啶不能生长。

12.  权利要求11的方法，其中导入的活性pyrG基因侧翼为相同核酸序列片段，在不含尿嘧啶和氟乳清酸培养基上选择通过导入pyrG基因和侧翼序列而产生的pyrG阳性酱油曲霉，接着将pyrG阳性酱油曲霉在包含尿嘧啶和氟乳清酸的培养基上培养，从而消除已导入的pyrG基因，由此产生pyrG阴性酱油曲霉，其可通过在包含尿嘧啶的培养基上生长和氟乳清酸抗性加以选择，适当地，侧翼序列和pyrG基因的侧翼进一步包括指导pyrG基因和侧翼序列整合入特异位置的序列，因为整合指导序列与待转化的酱油曲霉的特异序列同源，从而如果需要可剔除与该特异序列相关的基因。