[发明专利]突变细菌株的L－赖氨酸生产

说明书

                        发明背景

发明领域

本发明涉及微生物学和微生物遗传学领域。更具体地，本发明涉及在氨基酸的发酵生产中有用的新菌株、方法和工艺。

相关技术

在意识到棒杆菌(Corynebacterium)可用于氨基酸的发酵生产(S.Kinoshita等，国际酶化学讨论会的会报(Proceedings of InternationalSymposium on Enzyme Chemistry)2：464-468(1957))之后，工业生产L-赖氨酸成为经济上重要的工业生产方法。商业生产这种必需氨基酸主要是利用革兰氏阳性菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)来实现的(Kleemann，A.等，“氨基酸(Amino Acids)”，《Ullmann氏工业化学百科全书》(ULLMANN’S ENCYCLOPEDIA OFINDUSTRIAL CHEMISTRY)，第2卷，第57-97页，Weinham：VCH-Verlagsgesellschaft(1985))。目前，这些生物每年产生约250,000吨L-赖氨酸。

通过分离产生更大量L-赖氨酸的突变菌株可以增加商业生产L-赖氨酸的效率。在生产氨基酸的微生物工艺中使用的微生物可划分为4类：野生型菌株、营养突变株、调节突变株(regulatory mutant)和营养缺陷型调节突变株(K.Nakayama等，《食物和食用蛋白质的营养改良》(Nutritional Improvement of Food and Feed Proterins)，M.Friedman编，(1978)，第649-661页)。棒杆菌和相关生物的突变株使得可以廉价地从便宜的碳源如糖蜜(mollasses)、乙酸和乙醇通过直接发酵生产氨基酸。此外，通过发酵产生的氨基酸的立体专一性(L型异构体)使得该方法优于合成方法。

考虑到通过发酵方法生产L-赖氨酸在经济上的重要性，明显地为了增加产生的L-赖氨酸的总量和降低生产成本，目前已对赖氨酸合成的生物化学途径进行了深入研究(最近Sahm等，Ann.N.Y.Acad.Sci.782：25-39(1996)对此作了综述)。L-天冬氨酸是进入赖氨酸途径的开端(见图1)，其本身通过草酰乙酸的转氨基作用产生。谷氨酸棒杆菌的特殊性质在于它能通过两个不同的途径，即通过涉及琥珀酰化中间物的反应或通过二氨基庚二酸脱氢酶介导的单一反应，将赖氨酸的中间物哌啶2，6-二羧酸转化为二氨基庚二酸。总的来说，可在两点上调节进入该途径的碳流：首先，通过L-苏氨酸和L-赖氨酸水平对天冬氨酸激酶的反馈抑制；其次，通过对二氢吡啶二羧酸合成酶水平的控制。由此，可以通过下调和增加这两个酶的活性在棒杆菌中增加L-赖氨酸的产生。

除了导致L-赖氨酸合成的生化途径外，近来的证据指出L-赖氨酸向细胞外培养基中的运输是开发超量产生赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株的另一考虑因素。Kramer和同事的研究指出，由于膜渗漏造成的赖氨酸向细胞外的被动运输不是赖氨酸外流的唯一解释；他们的数据提示了具有如下性质的特殊载体：(1)该转运蛋白对赖氨酸具有相当高的Km值(20mM)；(2)该转运蛋白是OH^-同向转运系统(摄取系统是H⁺反向转运系统)；和(3)该转运蛋白带正电荷，而且膜电位刺激分泌(S.Broer和R.Kramer，Eur.J.Biochem.202：137-143(1991))。