[发明专利]具有特异结合性质的β－折叠蛋白质的设计

说明书

本发明涉及具有新的或改变的特异结合性质或者新的或改变的催化活性或者新的或改变的荧光性质的新的β-折叠蛋白质，并且还涉及以这样一种方法改进制备蛋白质的方法。

在人和兽医治疗诊断和监测的很多领域使用抗体及其衍生物。使用天然存在的抗体的一个问题是其制备。仍然在动物细胞培养系统中生产抗体，这是一个成本非常高的方法。在一些应用中，例如，融合蛋白的制备或者要求快速血液清除率和好的组织穿透性的治疗用途，天然存在的抗体分子的大小代表另一个问题(Colcher等，1998)。重组抗体分子例如scFvs(Bird等，1988)，小抗体(Pack和Plückthun，1992)或者双特异性抗体(Holliger和Winter，1993)主要只是由抗体的抗原结合区(VH和VL)组成。由于它们的长度显著降低，它们表现出改善的组织穿透性，并且与完整的抗体相比它们更适合与其它蛋白质融合。与后者相比，尽管重组抗体片段常常更不稳定，但是由于形成二硫键，所以它们具有低的亲合性并且难以以重组体形式制备。重组抗体片段的稳定和改进亲和性的方法其中包括测试各种接头多肽并且引入二硫键(Glockshuber等，1990，Cumber等，1992，Brinkmann，1997)。

接头肽的序列和长度能影响抗蛋白酶的稳定性和抗体片段的亲和性(Pantoliano等，1991)。向可变区的保守构架区引入另外的二硫键能导致对热(Young等，1995)和变性剂的提高的抗性并且导致异源表达产率提高。但是，一般情况下，很多scFvs表现出低稳定性并且趋向于在37℃就已经凝聚。通过使用常规的能够导入新的不稳定突变的Fv-片段克隆引物也可能导致不稳定性。通过输出到壁膜间隙中主要在细菌体系中产生抗体片段，优化确定的氧化还原态和同步表达折叠辅助因子在这里也是可能的。

本发明的一个目的是提供具有新的或改变的结合性质例如抗体样性质，但是，同时，不表现出完整或重组抗体分子的上述缺点的新的蛋白质。

本发明的进一步目的是提供表现出新的或改变的酶学性质或催化性质的蛋白质。

本发明的再一个目的是形成上述蛋白质的制备方法。

通过具有权利要求1特征的蛋白质实现上述目的。制备本发明的蛋白质的方法是权利要求21。本发明的优选实施方案见从属权利要求和下面的说明书。

β-折叠蛋白质的表面的改变产生以前蛋白质中不存在的新的结合性质。通过诱变β-折叠区产生这些结合性质。除了从头结合性质外，该新的β-折叠蛋白质就结构和稳定性来说类似于起始蛋白质。用于设计新的结合分子的起始蛋白质是具有优势β-折叠结构的蛋白质，例如，Y-结晶，眼晶状体结构蛋白。根据结晶结构，通过例如计算机方法，选择暴露在表面上并且因此可接触溶剂或可能的结合配偶体的该起始蛋白质的β-折叠区和氨基酸。使用基因工程方法在编码起始蛋白质的基因中诱变这些区或氨基酸位置。因此，在DNA水平制备多种编码不同的β-折叠蛋白质突变体的突变基因(库或文库)。借助合适的筛选系统，例如噬菌体展示系统，分离具有新的期望的结合性质的突变体。在噬菌体展示中，所有制备的蛋白质突变体都暴露在噬菌体表面(噬菌体展示文库)。对这些重组噬菌体研究它们与期望的靶分子的结合。通过反复筛选浓缩并分离与靶分子特异性结合的在它们的β-折叠突变体表面上暴露的噬菌体。从噬菌体获得编码结合β-折叠突变体的基因并且在合适的表达系统例如大肠杆菌中表达。使用描述的方法出人意料地可能从不具有特异性结合性质的β-折叠蛋白质制备特异性结合蛋白质，并且通过应用合适的筛选方法从该文库分离具有期望的特异性的突变体。根据起始蛋白质的性质，用所述系统产生的β-折叠突变体具有关于大小，稳定性和在异源的优选细菌系统中产生功能活性等方面与例如抗体和重组抗体片段相比有优点。该新的β-折叠突变体的这些改进的性质使其可能代替例如抗体，催化抗体的重组抗体片段，并且开辟了完全新的应用领域。

例如，通过设计蛋白质能够根据本发明解决如上所述使用抗体的问题，所述设计的蛋白质各自具有特异结合性质和抗低pH，变性剂和高温度的高稳定性，即其耐受抗体在那些条件下不稳定的条件。但是，产生具有β-折叠结构和抗体样结合性质的蛋白质只是本发明应用领域的一种可能性。例如，通过产生具有新的催化性质例如阻抗性质和荧光性质的β-折叠蛋白质开放了另一种可能的应用。荧光性质能够被改变的蛋白质的一个例子是GFP。天然高度稳定的小蛋白特别适合用于设计。根据本发明在保持其稳定下产生其表面的改变，例如使蛋白质有新的特异结合性质。