[发明专利]用于多核苷酸序列线性等温扩增的方法及组合物

说明书

相关申请的参照

本发明申请要求的优先权申请是申请日为1999年9月13日、申请号为60/153,604的美国临时专利申请和申请日为2000年1月12日、申请号为60/175,780的美国临时专利申请，这两件申请作为参考全部并入文本。

技术领域

本发明涉及多核苷酸扩增技术领域。更具体地说，本发明提供了利用单个的RNA/DNA组合引物扩增(即进行多次复制)靶多核苷酸序列的方法、组合物及药盒，该扩增技术任意地包括转录作用。

背景技术

核酸扩增和扩增产物检测方法的发展近年来业已改进了核酸序列的检测、鉴定、定量以及序列分析。

核酸分析可用于检测和鉴定病原体、检测导致确定表型的基因变异、诊断遗传病或对疾病的敏感性、评估发育、疾病和对特定刺激的反应以及不同基因组测序计划中的基因表达。核酸扩增方法的其它应用包括稀少细胞的检测、病原体的检测以及恶性肿瘤中变异基因表达的检测等等。核酸扩增技术可潜在地用于定性分析(诸如检测确定核酸序列的存在)以及确定基因序列的定量分析。其中后者可用于病原体序列的评估和定量，以及基因增殖或缺失的测定(例如经常出现在从正常细胞到肿瘤细胞的细胞转变中)。

核酸序列中的序列变异检测对于突变基因型的检测(例如有关基因分析)、导致抗药性和药物遗传性的突变检测等是非常重要的。用于检测特异突变的不同方法包括等位基因特异的引物延伸、等位基因特异的探针连接反应以及鉴别探针杂交(参见例如U.S.5,888,819；6,004,744；5,882,867；5,710,028；6,027,889；6,004,745；和WO US88/02746)。还描述了无需专门知道变异而检测确定核酸序列中序列变异的存在的方法。其中一些方法是基于对测试扩增产物与参比扩增产物杂交而形成的错配序列的检测。通过利用错配序列的结合蛋白或者通过错配序列的化学或酶裂解可以检测这些异源双链体中的错配序列的存在。最近描述了一种基于十字形四链DNA结构的分支移位抑制而检测序列变异的方法[参见例如Lishanski，A.等人的Nucleic Acids Res 28(9)：E42(2000)]。其它方法是基于对单链扩增产物的特异构象的检测。单链DNA或RNA的第二结构取决于特定的序列。相对于参比序列的测试核酸靶物的序列变异导致构象的改变。利用与参比扩增产物的电泳迁移率相比而改变的测试扩增产物的电泳迁移率可检测单链扩增产物的改变的构象。单链构象的多态性(SSCP)可广泛地用于序列变异的检测[参见例如Orita M.，等人的Proc Natl AcadSci U S A 86(8)：2766-70(1989)；Suzauki，Y.等人的Oncogene5(7)：1037-43(1990)；U.S.5,871,697]。该方法还可用于基于不同菌株或样本的特定核酸序列的确定变化而进行微生物的鉴定。利用SSCP法的突变检测大多采用DNA扩增产物，然而，还业已描述了RNA-SSCP法。依赖于序列的单链RNA构象被公证和示出，从而导致确定的电泳迁移图形[参见例如Sarkar等人的Nucleic Acid Research 20(4)：871-878(1992)和Gasparini等人的Hum.Genet.97：492-495(1996)]。

虽然可利用探针杂交来完成确定核酸序列的存在的检测及其序列分析，但是当测试样品中存在低量的(例如较少的分子)核酸序列时，该方法通常缺乏灵敏度。解决这个障碍的一个方案是开发出用于产生确定核酸序列的多个拷贝(适用于进一步的分析)的方法。这些产生特定核酸序列的多个拷贝的方法通常被定义为靶扩增方法。用于提高杂交分析检测灵敏度的其它方法是基于由杂交探针或探针生成多个产物，例如杂交探针的裂解形成了多个产物或者相邻探针的连接反应形成一个独特的依赖于杂交的产物。同样，利用由杂交作用产生的信号的扩增方法例如基于分支DNA探针杂交的方法可获得灵敏度增大的杂交反应。