[发明专利]细胞的条件性永生化

说明书

发明领域

本发明涉及用于治疗性应用的哺乳动物细胞的永生化。

发明背景

人们对于移植疗法治疗组织和器官损伤的重要性的认识和理解正在不断增加。而当器官移植正在被广泛实施的时候，以单个细胞移植为基础的移植疗法仍然处于临床发展的相对早期。

举例来说，人们正在不断增加关于将合适的细胞移植进受损伤的大脑可能改进或纠正任何由损伤所引起的知觉、运动、行为、心理上的缺损的认识。

要使以细胞为基础的疗法得以应用，就一定要有可能获得充足的可供移植的细胞。确保这一点的一个方法是在允许重复细胞分裂和生长的条件下培养未分化细胞。使用未分化细胞的一个困难之处是不受调节的细胞分裂一定要在细胞移植进入患者体内之前或之时被关闭掉，以避免它在移植部位不受抑制地生长。

人们发展了许多不同的技术以提供合适的细胞供移植使用。关于神经移植的一项研究是在允许发生细胞分裂的条件下维持培养未分化的胎儿细胞，随即在移植之前，在体外诱导分化。

Reynolds和Weiss，科学(Science)，1992；255：1707，表明使用上皮生长因子(EGF)可以在体外诱导成年鼠脑细胞增殖。据认为在合适的条件下，该细胞可以被诱导分化为星形胶质细胞和神经元。

国际专利申请WO-A-94/16059号透露了一项体外维持原代神经细胞培养的技术，就是在补充了至少一种营养因子的无血清培养基中培养该细胞。

国际专利申请WO-A-97/10329号透露了另一项备选技术，就是使用条件性永生细胞系。该细胞系含有一个永生化温度敏感癌基因，该癌基因在允许情况下，维持神经上皮干细胞处于未分化状态。移植后，由于人的体温较高(37℃)，癌基因被关闭，并且细胞也分化成所需要的细胞类型以修补损伤。使用癌基因的优点是能使细胞维持在未分化状态直到移植，此时，细胞对应于特有的损伤，分化为受损伤或丢失的细胞的表型。美国专利5688692也展示了表达非DNA结合的、温度敏感的T抗原的细胞。

然而应当承认，虽然表达癌基因的人类细胞的生命得以延长，但是它们仍然会停止分裂并最终经历极期(细胞死亡)。

也有人建议通过整合人的端粒末端转移酶催化亚基的外源拷贝而重建端粒末端转移酶活性，从而使人类细胞永生化(Bodnar等，科学(Science)，1998；279：249-252)。端粒末端转移酶起着维持染色体末端的端粒的作用，而且人们相信正是在细胞复制期间端粒的逐渐缩短促成了衰老，因此重新构建了端粒末端转移酶以使细胞永生化。人的端粒末端转移酶现在已经被用来使许多不同类型的细胞永生化。

Counter等，PNAS(美国)，1998；95(25)：4723-14728，也表明端粒末端转移酶催化亚基(hTERT)的异常表达能允许终末衰老细胞增殖，超越极期而达到细胞永生化。被研究的细胞是用表达SV40 T抗原的癌基因转化的。然而，作者推断单独hTERT表达可能足以使细胞永生化，而且hTERT的激活作用可能是肿瘤进展的一个关键性步骤。因此，该文章的综合结论就是用hTERT转化细胞会使细胞永生化。这意味着这样的细胞不适合用于移植疗法。

因此，尽管许多上述公开的技术可能是有用的，但仍然需要某些方法，以获得在移植之前保留无限增殖能力，而在移植后则失去无限增殖能力的细胞。

发明概述

本发明的基础是实现了用条件性诱导癌基因和至少端粒末端转移酶复合物的催化亚基转导的细胞在允许条件下是可以无限增殖的，但在非允许条件下则失去无限增殖性。

依照本发明的一个方面，重组或遗传工程哺乳动物细胞包含条件性诱导或温度敏感癌基因，和编码至少端粒末端转移酶复合物的催化亚基的外源性多核苷酸。

依照本发明的第二方面，重组多核苷酸结构包含编码至少端粒末端转移酶复合物催化亚基的基因，和条件性诱导或温度敏感的癌基因。

依照本发明的第三方面，使哺乳动物细胞永生化的方法包括在正在增殖的哺乳动物细胞中引入条件性诱导癌基因和编码端粒末端转移酶基因催化亚基的外源性多核苷酸。

依照本发明的第四方面，本发明的细胞可以用在治疗方面，特别是用于制造药物，以治疗与细胞丧失或损伤有关的疾病。举例来说，神经上皮干细胞可以用于治疗与脑损伤有关的病症，例如阿尔茨海默氏病。

已经发现本发明的细胞保持高度的稳定性以及在非允许温度下不能无限增殖。