[发明专利]溶瘤腺病毒

说明书

                       发明领域

本发明涉及腺病毒载体，以及用于生成和使用这些载体的方法。更具体的说，本发明涉及在E1A和/或E4区启动子中包含突变和替代从而赋予显著的肿瘤细胞特异性溶瘤活性的改良型腺病毒载体。

                         背景

早在本世纪早期，病毒就已经被用于治疗癌症。这种方法包括两个部分：第一，分离或生成在赘生性细胞中选择性复制并选择性杀死肿瘤细胞同时不伤害正常细胞的溶瘤病毒。研究人员最初使用野生型病毒，这种方法获得了一些但有限的成功。在溶解肿瘤并减缓肿瘤生长且很少或不损伤正常组织的同时，疾病进程却没有显著改变。参阅Smith等人，癌症(Cancer)9：1211-1218，1956；W.A.Cassel等人，癌症(Cancer)19：863-868，1965；H.E.Webb等人，柳叶刀(Lancet)1：1206-1209，1966；S.Kenney和J.Pagano，国家癌症协会会刊(J.Natl.Cancer Inst.)86(16)：1185，1994。

最近，由于与野生型病毒应用的有限功效有关的疾病复发，研究人员已经开始采取能够以高剂量投递、能够在赘生性细胞而非正常细胞中复制的重组病毒。这些病毒自身是有效的溶瘤剂，而且经改造能够携带并表达增强病毒抗赘生物活性的转基因。这类病毒的范例是病毒基因组E1B区突变的腺病毒。参阅美国专利号5,677,178；J.R.Bischoff、D.H.Kim、A.Williams、C.Heise、S.Horn、M.Muna、L.Ng、J.A.Nye、A.Sampson-Johannes、A.Fattaey、和F.McCormick，科学(Science)274：373-376，1996。

重要的是将含或不含用于治疗癌症的转基因的复制型病毒与研究人员使用的第二种方法即表达转基因的非复制型病毒区分开来。在第二种方法中，病毒只作为投递直接或间接负责杀死赘生性细胞的转基因的载体。这种方法已经成为并将继续作为使用病毒治疗癌症的主要方法。然而，它取得的成功有限，而且显得不如复制型病毒有效。不过，已经将外源基因插入E1区(参阅McGrory，病毒学(Virology)163：614-617，1988)、E3区(参阅Hanke，病毒学(Virology)177：437-444，1990；Bett，病毒学杂志(J.Virol.)67：5911-5921，1993)，或者插入删除E1区载体的E3区。

如上所述，为了避免正常组织受到高剂量病毒疗法的损伤，优选的是，病毒具有促进其在肿瘤细胞中复制由此增强溶瘤活性但对正常细胞基本上无害的突变。这种方法利用了下面的观察结果：控制正常细胞生长的许多细胞生长调控机制在赘生性细胞中被灭活或丧失，而且病毒灭活这些相同生长控制机制以促进病毒复制。因而，灭活特定正常细胞生长控制机制的病毒基因删除或灭活将防止病毒在正常细胞中复制，但是这些病毒将在缺乏特定生长控制机制的赘生性细胞中复制并杀死这些肿瘤细胞。

例如，正常分裂中细胞瞬时缺乏在某些赘生性细胞中缺乏的并与其无限生长有关的生长控制机制，成视网膜细胞瘤肿瘤抑制基因(RB)。成视网膜细胞瘤肿瘤抑制基因基因功能的丧失与多种类型肿瘤的病因学有关。这种肿瘤抑制基因的产物，称为pRB或p105的105kD多肽，是细胞周期调控蛋白。pRB多肽通过将细胞滞留在细胞周期的G1期来抑制细胞增殖。pRB蛋白质是几种DNA病毒癌蛋白的主要靶，包括腺病毒E1a、SV40大T抗原、和乳头瘤病毒E7。这些病毒蛋白质结合并灭活pRB，而灭活pRB的功能在促进病毒复制中是重要的。pRB蛋白质与涉及腺病毒E2基因和几种细胞基因表达的E2F转录因子相互作用，并抑制这种转录因子的活性(Bagchi等人，细胞(Cell)65：1063，1991；Bandara等人，自然(Nature)351：494，1991；Chellappan等人，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：4549，1992)。