[发明专利]含修饰的多不饱和脂肪酸的植物

说明书

引言

本申请要求于1999年8月26日申请的美国临时申请系列号为60/151,224和于1999年12月17日申请的美国临时申请系列号为60/172,128的优先权。

技术领域

本发明涉及核酸序列和构建体，以及与之相关的方法。

背景技术

植物油有多种用途。我们需要新的植物油成分和/或改善从生物合成或自然植物途径获得植物油成分的方法。根据油的目的用途，需要多种不同的脂肪酸成分。

一种假定的获得这些油类和/或改变脂肪酸成分的方法是通过植物基因工程的方法。然而，有必要识别能产生预期表型结果的合适的核酸序列以及能介导这些序列正确应用的调节区域等等。

高等植物似乎通过通常的代谢通路(脂肪酸合成通路)合成脂肪酸。在发育的种子中，脂肪酸连接到甘油主链上，形成甘油三酯，储存作为进一步萌芽的能量来源，这时的FAS通路位于原质体。最关键的步骤是通过乙酰-辅酶A：ACP转酰基酶(ATA)催化乙酰-辅酶A和ACP形成乙酰-ACP(酰基载体蛋白)。将乙酰-ACP延长至16和18个碳原子脂肪酸包括以下反应系列的循环反应：用二碳单位将丙二酰-ACP缩合形成β-酮脂酰ACP(β-酮脂酰ACP合酶)，缩酮形成乙醇(β-酮脂酰-ACP合酶)，脱氢形成烯酰-ACP(β羟酰-ACP脱氢酶)，最后将烯酰-ACP还原成延长的饱和酰基ACP(烯酰-ACP还原酶)。β-酮脂酰ACP合酶I催化延长成棕榈酰-ACP(C16：0)，而β-酮脂酰ACP合酶II催化最终延长成硬脂酰ACP(C18：0)。在储藏甘油三酯中常见的植物不饱和脂肪酸，如油酸、亚油酸和亚麻酸，来源于硬脂酰-ACP在由可溶性质粒Δ-9去饱和酶(也叫“硬脂酰-ACP去饱和酶”)催化的反应中发生去饱和作用形成油酰基-ACP(C18：1)。在去饱和过程中需要分子氧的参与，其中还原型铁氧化还原蛋白作为电子的共供体。另外的去饱和作用继续被膜结合性的Δ-12去饱和酶和Δ-15去饱和酶作用影响。因此，这些“去饱和酶”分别产生了单-或多不饱和脂肪酸。

获得能产生表型结果的核酸序列—该表型可以经脂肪酸合成(FAS)、脂肪酸去饱和作用和/或将脂肪酸整合入甘油主链以产生一种油—须遭受多种障碍包括但不局限于，识别需要的代谢因子、用合适的动力特征选择和鉴定酶的来源、将需要的蛋白纯化至可以使氨基酸测序的水平、利用氨基酸序列数据获得能用作探针提取需要的DNA序列的核酸序列、以及构建体的制备、转化和所获植物的分析。

因此，需要另加的靶核酸和修饰脂肪酸成分的方法。特别是需要产生多种范围的不同脂肪酸成分的构建体和方法。

发明概述

本发明总体涉及基因组去饱和酶多核苷酸，特别是编码催化在脂肪酰链从羧基末端数第12(Δ-12去饱和酶或fad2)或第15(Δ-去饱和酶或fad3)位碳的脂肪酰基部分插入双键的酶的基因组去饱和酶多核苷酸。另外，本发明提供了分离的这类基因组多核苷酸序列的非编码区域，特别包括内含子和启动子区域。本发明还提供了包括来源于Δ-12和Δ-15去饱和酶启动子和内含子序列的部分或全部序列的特异寡核苷酸。虽然本公开的序列是从大豆植物中获得的，但是，也可以考虑来源于与大豆去饱和酶序列同源或相同的去饱和酶基因组多核苷酸序列的内含子和启动子区域附加序列。所述的附加去饱和酶序列可以使用下面描述的标准方法从多种植物中获得，尤其是从含油种子作物中获得。

本发明的另外一个方面提供了在植物中用于改变脂肪酸成分的重组DNA构建体，尤其是改变去饱和酶基因或蛋白，如Δ-12和Δ-15去饱和酶，的转录或转录和翻译(表达)。本发明尤其涉及包含来源于基因组克隆的内含子或启动子区域的序列的DNA构建体，其中所述的序列在DNA构建体中的方向是正义方向或反义方向。然后将这些DNA构建体用于转化或转染宿主细胞，产生使脂肪酸水平，尤其油酸、亚油酸和亚麻酸水平发生变化的植物。本发明尤其有计划提供了下调Δ-12和Δ-15去饱和酶基因表达的构建体和方法，以便增加油酸水平，降低亚油酸和亚麻酸水平。本发明还有计划的改变了含油种子作物的种子组织中的脂肪酸成分。