[发明专利]构建融合文库的方法和组合物及该文库的用途

说明书

本专利申请要求在1999年8月20日申请的美国临时专利申请系列号60/150,004号和在2000年6月2日申请的系列号60/209,130的优先权。

                       发明领域

本发明涉及编码NAM酶融合蛋白质的基因文库和识别目的核酸的使用方法。

                       发明背景

DNA技术和生物信息学的改进使科学界能够获得一些微生物的天然基因组序列，同时高等真核生物和哺乳动物的基因组序列也接近完成。各种生物体DNA序列的迅速积累表现出巨大的潜在科学和商业机会。但是，在许多情况下，获得的天然序列不能翻译成它们所编码的生物、制药或工业方面有用的信息。因此，本领域需要有效地、系统地和尽可能地揭示天然和合成的DNA序列的功能和作用。

揭示给定DNA序列潜在功能的几种普通方法已有报道。一种方法是依靠生物信息学工具，这也是发现基因和靶目标的基本方法。生物信息学软件可从几个专门从事将序列数据组织录入计算机数据库的公司获得。研究者能够将未定性的核酸序列与数据库中已知基因的序列相比较，由此就能提出关于核酸序列编码的基因产物的功能的理论。但是，生物信息学软件很昂贵，通常需要为有效使用而进行大量的训练，且仅能使研究者推测一个编码的基因产物的可能功能。此外，越来越多的DNA序列经过鉴定发现与已知功能的基因之间没有序列上的联系，而且对于许多所谓“已知”的基因也发现了许多新的特性。因此，生物信息学只提供了有限的信息，必须谨慎使用。所有信息学预测的特性需要实验证实。

另一个关联序列数据与功能的方法是对单个基因功能进行试验性的检测。在以前描述的方法中，核酸序列采用许多表达构建物的任何一种来表达以获得一个编码的肽，然后经过检测来鉴定具有所需特性的肽。许多以前描述的方法中固有的难点是将目标特性与其编码核酸序列联系起来。换句话来说，当将大量的核酸和肽序列及其探明的编码功能集中在一起时，就越来越难鉴定和分离具有所需功能的编码序列。

通过将表达的肽和编码它的遗传物质连接起来缓解了与处理大量核酸序列集，如基因文库相关的主要难题。一个将肽与其编码核酸联系起来的方法是使用多核糖体显现。多核糖体显现方法主要包括在体外翻译RNA，并将新生蛋白复合到其相应的RNA上。复合体是通过控制编码序列来构建的，这样核糖体就不会释放新生蛋白或RNA。通过回收目标蛋白，研究者可以获得相应的RNA，因此经已知的方法如逆转录酶结合PCR将RNA转变成DNA后，就可以获得编码的DNA序列。然而，多核糖体显现的方法只能在体外进行，操作困难，且需要无核酶的环境。由于体外翻译机制的起始蛋氨酸密码子替换和较少完整进程的性-质，这种方法不适用于大的蛋白。另外，RNA-蛋白-核糖体复合体是不稳定的，因此限制了适合多核糖体显现复合体所用的筛选方法和工具。