[发明专利]重组融合分子

说明书

本发明涉及一种提高细胞内蛋白产量的方法，特别是在植物细胞内的生成。此发明也涉及重组免疫融合复合物，特别是它们在植物体的表达。

重组蛋白已在多种转基因植物中获得表达。其中存在一个难以攻克的问题——表达水平低，给后序的纯化和加工带来困难。为此，采取了多种措施来克服这个问题，例如用不同的调节基因结构或构建人工基因，但取得的进展是有限的。目前报道的可溶性蛋白的表达水平为0.5％，而许多实例是少于0.01％的。抗体在植物体中的表达是一个显著的反例。我们的试验中，通常1％的表达水平是预料之中的，也可达到5～8％的表达水平。造成这种不同的原因还不清楚，我们认这与抗体分子在植物体中的固有的稳定性，以及植物细胞器处理这些蛋白的方式有关。

免疫复合物包含抗体和抗原，并产生经典的免疫应答。通常，当抗原与抗体混合时，它们通过抗体的结合位点和抗原表位允许分子结合，从而产生免疫复合物。这一过程的缺点是，免疫复合物要求在体外将抗原和抗体在最佳浓度下小心地混合。

本发明提供一种提高细胞内蛋白产量的方法，包括表达编码重组融合蛋白的重组DNA，该重组融合蛋白包含一种融合到抗体重链的恒定区或所述恒定区的部分的所需蛋白。

为方便起见，术语“重链恒定区”在以下的描述中根据上下文用来指免疫球蛋白重链恒定区的全长或者该区域的一部分(片段)。根据抗体的分类，恒定区包含许多的区域(结构域)。对于IgG抗体，恒定区包括三个区域(结构域)即CH1，CH2，和CH3；CH3结构域是C-末端结构域。因此，代替使用全长恒定区，也可以使用它的截短部分包括结合的CH1/CH2，CH2/CH3，或CH1/CH3结构域。

通过使用免疫球蛋白的高表达，我们发现它可能会提高重组融合蛋白的表达水平。

这种所需蛋白可以是任何蛋白包括报道分子，例如β-牛乳糖，荧光素酶和GFP，也可以是一种可选择的标记，例如抗生素。

优选的所需蛋白是一种食物蛋白例如一种储存蛋白，像菜豆蛋白或麦谷蛋白(wheat gluten)。

优选的所需蛋白是一种治疗蛋白。治疗上有效的蛋白包括受体例如囊性纤维化受体(CFTR)、酶包括药物前体活化酶，例如硝基还原酶、配体、调节应子、激素和结构蛋白。治疗蛋白也包括编码核蛋白、细胞质蛋白、线粒体蛋白、分泌蛋白、原生质膜结合蛋白和血清蛋白。所需蛋白也可以选自脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、激素、生长因子、酶、凝血因子如第十三因子和第九因子等、阿朴脂蛋白、受体、促红细胞生成素、药物、致癌基因和肿瘤抑制基因。这些化合物中的具体例子包括：胰岛素原，生长激素，雄激素受体、胰岛素样生长因子I，胰岛素样生长因子II，胰岛素样生长因子结合蛋白，表皮生长因子，血管生成因子(酸性成纤维细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，血管内皮生长因子和血管生成素)、间质蛋白(IV型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、层粘连蛋白)、苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、致癌基因(ras，fos，myc，erb，src，sis，jun)、E6或E7转化序列、p53蛋白、Rb基因产物、细胞因子受体、IL-1、IL-6、IL-8、病毒衣壳蛋白和机体内其它有用的蛋白。此可被融合的所需蛋白，仅受限于编码被合并的蛋白或多肽的核酸序列的可获得性。本领域技术熟练人员很容易地认识到随着更多的蛋白和多肽被鉴别，它们可被整合到本发明的重组融合蛋白上。

特别优选的所需蛋白是一种抗原。这里使用的术语“抗原”指能在动物体内如哺乳动物，特别是在人体内产生免疫应答的任何蛋白。优选地，这里使用的术语“抗原”指在动物体内刺激一系列反应的蛋白，该反应由白细胞包括淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞介导。优选的抗原包括病毒抗原、细菌抗原、原生动物抗原、寄生抗原、肿瘤抗原和来自病毒、细胞和寄生物的可用来引起免疫应答反应的蛋白。优先的抗原不能是一种毒素。毒素在这里定义为对细胞有直接的毒性影响并引起细胞死亡的蛋白。最优选的抗原是人免疫缺陷病毒gp120，无毒的C-破伤风毒素片段或牛呼吸道合胞病毒(BRSV)F-蛋白。

所需蛋白可以通过可包括肽剪切位点的中间连接肽直接或间接地连接到恒定区或其部分，这将允许所需蛋白为纯化目的从恒定区或其部分(如果需要)分离。所需蛋白对恒定区或其部分的附着可经重链或其部分的C末端实现。或者，抗原可被融合到抗体上，融合位点在恒定区内或其部分内。

本发明的方法适用在任何真核细胞中生产所需蛋白。优选地，该所需蛋白在能产生免疫球蛋白的真核细胞中生产。更优选地，该所需蛋白在哺乳动物细胞中生产，最优选的是在植物细胞中生产。