[发明专利]由原核核酸结合蛋白介导的分子物质转移法

说明书

本发明涉及一种将核酸和/或核酸类似物，和/或多种核酸和/或多种核酸类似物和/或含氨基酸物质，尤其是核酸，例如以质粒形式存在的DNA，转移进原核或真核细胞的方法。

发明领域和现有技术状况

转染是指，为了实现基因在细胞中的表达，引入核酸，如核苷酸、反义RNA、核酶、尤其是以质粒、染色体或染色体片段形式存在的DNA的过程。在此所用，术语转移是与之类似的，而在通常语言惯用法中，术语转染专门用于描述基因转移。除了核酸转移以外，附加活性物质如蛋白、肽、治疗药物和其他分子物质的定向有效转化也很重要。转移过程在生物医学基础研究和生物技术制药工业领域均具有重要意义。一些蛋白，其中含有治疗相关蛋白，只有在真核细胞中生产时，才能正确加工，因为甚至在翻译后也能对蛋白进行修饰的修饰机器在原核生物中多半不存在或者显著不同。相反，其它蛋白则利于在原核宿主细胞中生产，因为在原核宿主细胞中，可以经济方便地生产大量蛋白。此外，特定基因的转染和定向表达是一种在细胞和分子生物学中对生物过程进行定性描述和分析的重要手段。谈及产生具有新特性和含有新成分的植物(转基因植物)或抗除草剂植物，细胞转染是植物技术中一种重要方法。最后，在生物医学研究领域，定时用单链核酸(单链DNA或单链RNA)，或核酸衍生物[例如，肽核酸(peptide nucleic acids，PNAs)]转染细胞，这些物质作为效应子发生细胞内效应，例如通过所谓反义核酸技术专一性抑制蛋白合成。对于所有这些过程和方法中，相关核酸的特定转移是重要工序。

同样地，可以直接地将蛋白或肽运输进细胞的方法也是有关联的；此方法最重要的应用在治疗领域。例如，细胞内的抗体可被用来识别细胞内特定病原体并抑制它们。实现这一目的的一种方法是大分子物质进入靶细胞的电穿孔法；但是这种方法只能在体内应用，效率低并对细胞存在相对高的浪费(参见：E.J.Verspohl，I.Kaiserling-Buddemeier，A.Wienecke，将特异抗体导入电渗透细胞是一种去除细胞特定功能的重要方法，Cell.Biochem.Funct.Vol.15，127-134，1997)。

根据目前技术水平，对于将核酸转移进细胞而言，已有几种方法。其中有，如同前面提及的蛋白转移方法一样的物理方法，例如电穿孔法，其中通过与电场接触，细胞膜被穿孔，从而使大分子物质可以透过。然而，对于敏感细胞而言，电穿孔法常常存在困难，并且伴随低的细胞存活率。就真核细胞来说，根据现有技术水平，最常使用化学法，例如磷酸钙与DNA共沉淀法、高分子复合物形成法，如从DEAE-(二乙氨乙基-)葡聚糖法和DNA(参见：Y.W.Yang & J.C.Yang，DEAE-葡聚糖介导的基因转移研究，Biotechnol.Appl.Biochem.1997，Vol.25，47-51)或带有DNA的树状体形成法(参见：J.F.Kukowska-Latallo，A.U.Bielinska，J.Johnson，R.Spindler，D.A.Tomalia，& J.R.BakerJr.，利用Starburst聚酰胺型胺类树状体法将遗传物质高效转移进哺乳动物细胞，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996，Vol.93，4897-4902)。这些转染试剂的作用机制是：首先，将长的具有一定机械强度的线状核酸分子进行压缩；在多数情况下，这种压缩是核酸成功吸收进入细胞的重要先决条件。偶尔，可以利用多聚阳离子例如纯的或修饰的多聚赖氨酸介导转移(例如，参见专利WO 98/06869)。

在医药应用中，优选以阳离子脂类物质为基础的脂质体系统进行转移；该系统具有高效的优点。于是，出现了用不同来源和成分的的阳离子脂质体包合核酸的包合物(参见：商业产品，如Invitrogen公司的PerFect，Roche公司的FuGene，Life Technologies公司的Lipofectamine，Biontex公司的PolyFectin，及Stratagene公司的LipoTaxi)。有关此方面的全面、最新的综述可以参见文献：R.J.Lee&L.Huang，进行基因转移的脂类载体系统，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.1997，Vol.14，173-206。相当大量国际专利主要区别就在于所用脂质体的配方不同。