[发明专利]口服重组乳杆菌疫苗

说明书

发明概要

本发明属于疫苗开发领域。具体地说，本发明涉及口服疫苗开发。本发明涉及使用重组非致病菌作为口服应用后能够引发免疫应答的抗原的载体。更具体地说，本发明包括使用乳杆菌属(Lactobacillus)的乳酸细菌。所涉及的乳酸细菌在分类学上为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。所述抗原在所述乳酸杆菌细胞内表达和/或暴露于表面。由于所述疫苗使用活微生物作为抗原的载体，因此所述疫苗是活疫苗。本发明还包括新型重组植物乳杆菌以及其中使用的表达载体。

发明背景

一段时间以来，技术人员一直对这样的设计思想感兴趣：即发展基于非致病载体的口服疫苗，而不是使用目前商业化应用的减毒致病微生物如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)。发展这样的减毒株是慢长耗时的。这需要发展由于去除了致病性而对环境或个体没有危险的重组菌株。然而它们必须保持免疫原性，以便可以产生保护性免疫应答。另外一个问题是发展遗传性稳定重组菌株。使用原先致病的微生物存在这样的风险：对于所述载体本身的免疫应答会降低加强疫苗的效能，因为如果疫苗接种者已经接触过所述载体细菌，那么已经存在的抗体会造成这样的情况。最后，使用部分毒力载体株的个体群比使用其它载体系统时的风险更大。包括婴儿、老人和无免疫应答的个体。简而言之，长时间以来人们一直觉得需要安全有效的疫苗。

粘膜疫苗，即使用粘膜传递途径的疫苗，看起来比使用系统接种有若干好处。它们可以用于产生作为第一线防御的IgA型免疫应答。对粘膜感染的保护性免疫应答极大依赖于分泌型IgA分子的产生。这样的分子局部产生，并被转运到粘膜分泌产物中。

另一类可能有用的粘膜疫苗旨在通过所述疫苗的粘膜应用而不是胃肠外应用，诱导系统性免疫应答。理想状况下，所述免疫应答应该相当于足够有效的胃肠外疫苗所诱导的免疫应答。

然而，刺激粘膜免疫系统时，系统性应用抗原可能不起作用，或作用不可靠。不幸的是，特定抗原的口服给予通常也不导致足够的免疫应答，即使最终它导致某些应答。这是由于所述抗原在胃肠(G.I.)道中的吸收差和快速降解，以及对宿主的耐受性诱导。因此在过去提出了替代方案。

在尝试过的选择中，包括产生保护性载体系统如iscom、微球体和脂质体，以及使用无害的活微生物在体内局部产生(即在体内原位)所需的抗原。

在寻找用作抗原载体的无害微生物群时，乳酸细菌群看起来是合适的细菌。它们在食品生产技术中大规模应用。它们构成适于人类应用的一群食品级(即通常是GRAS状态)格兰氏阳性微生物。它们在食品中有大量安全使用的记录。在它们的好处中另一个有趣的方面当然是它们不含LPS(LPS存在于目前用作载体的一些致病微生物中)。这样，由于预期它们没有关于内毒素性休克风险的问题，因此它们对于通过粘膜途径应用显然是安全的。

此外，由于乳酸细菌能够定居(即能够居留和或生长)在诸如口腔、尿生殖道或胃肠道的腔道中，在这些部位它们的作用是维持正常微生物区系的平衡，因此它们作为益生菌进行生产。然而，目前没有商业化使用非致病细菌的口服疫苗。

在粘膜疫苗领域中，一方面人们必须区分鼻(以及阴道)疫苗，另一方面必须区分口服疫苗。口服抗原所面临的环境比鼻环境恶劣得多。此外，已经证实，能够在鼻应用中引发免疫应答的疫苗在口服应用时是不成功的。已经提出了使用非致病载体的鼻疫苗，但由于没有预期的特性或效能，无助于开发口服疫苗面临的问题。例如，已有关于使用重组干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和植物乳杆菌菌株作为鼻疫苗或在鼻疫苗中使用它们的介绍，这两种细菌对于该给予途径同样适合。令人惊讶的是，在本发明中已经发现植物乳杆菌株适于用作口服疫苗或用于口服疫苗中。与此不同-下文进一步讨论，本领域还未能就其它乳杆菌菌株获得相似的结果，例如已经建议用作鼻疫苗的干酪乳杆菌(Pouwels等，J.Biotech.1996 44：183-192；Pouwels等，Int.J.Food Microbiol.1998 41：155-167)。