[发明专利]Fungamyl样α－淀粉酶变体

说明书

                         发明领域

本发明涉及Fungamyl^TM样α-淀粉酶的α-淀粉酶变体(突变体)，具体是改进了在酸性pH值下的热稳定性。本发明也涉及这样的变体的应用。

                         发明背景

α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡糖苷水解酶，EC 3.2.1.1)组成一组酶，其可以催化淀粉和其它直链和支链1，4-葡糖苷寡糖和多糖水解。

有大量的专利和科学文献涉及此类在工业上很重要的酶。被称为“Termamyl^样α-淀粉酶”的α-淀粉酶及其变体可从例如WO 90/11352，WO95/10603，WO 95/26397，WO 96/23873，和WO 96/23874中了解。Termamyl样α-淀粉酶热稳定性很高，因此适于高温下的处理过程，如葡萄糖生产过程中的淀粉液化。

还有一组称为“Fungamyl^TM样α-淀粉酶”的α-淀粉酶，它们与得自米曲霉的α-淀粉酶(表示为SEQ ID NO：1)相关。这些Fungamyl样α-淀粉酶热稳定性相对较低(Novo Nordisk，丹麦，的商品名为FUNGAMYL^的市售产品，最适温度约为55℃)，因此不适于在高温下进行处理。目前Fungamyl样α-淀粉酶用于制造，例如酿造工业所用糖浆。这样的处理在约60℃下进行，导致由于其热稳定性较低而加入的酶量必需加倍。此外，在55℃下可能会出现污染问题。

还由于目前这样的处理在pH5.5下，而不是，例如pH4.5进行，故必需调整pH并向糖浆中加入钠。

因此，提供优选在酸性pH条件下热稳定性提高的Fungamyl样α-淀粉酶是有利的。

                         发明简述

本发明目的是提供Fungamyl样α-淀粉酶变体，具体是改进了特别是在酸性pH下的热稳定性。

术语“改进了热稳定性的α-淀粉酶变体”在本文中指比相应的亲本α-淀粉酶有较高热稳定性的α-淀粉酶变体。热稳定性如下文在材料和方法部分所述进行确定。

如下所述，本发明人提供了改良的Fungamyl样α-淀粉酶变体。

                         发明详述

本发明目的是改进Fungamyl样α-淀粉酶的热稳定性，尤其在酸性pH下。

鉴定为改进热稳定性而要突变的位点和/或区

分子动力学(MD)模拟指示蛋白质结构中氨基酸的可变性(mobility)(参见McCammon，JA和Harvey，SC.，(1987)，“Dynamics of proteins and nucleicacids”.Cambridge University Press.)。这样的蛋白质动力学经常与晶体学B-因子(参见Stout，GH和Jensen，LH，(1989)，“X-ray structuredetermination”，Wiley)或B-因子自身对比。通过在可滴定残基的不同质子化状态进行MD模拟，模拟了残基的pH相关可变性。选择具有最高可变性或灵活性(flexibility)(在此为各向同性的波动)的区进行随机诱变。在此应理解地是在蛋白特定区发现的高流动性可通过在这些残基进行替换而改进热稳定性。所述替换针对具有较大的侧链和/或能改进与周围残基的接触的残基。得自米曲霉表示为SEQ ID NO：2的亲本Fungamylα-淀粉酶骨架用于所述MD模拟。

通过分子动力学(MD)模拟或B因子检查(如收入Protein DataBase(PDB)(www.rcsb.org)file 6TAA(Swift，H.J.，Brady，L.，Derewenda，Z.S.，Dodson，E.J.，Dodson，G.G.，Turkenburg，J.P.，Wilkingson，A.J.：Structure and molecular model refinement of Aspergillus oryzae(TAKA)alpha-amylase：an application of the simulated-annealing method.Acta CrystallogrB 47 pp.535(1991))发现的适合进行突变，以获得具体是改进的热稳定性的区如下所列：

98-110区，