[发明专利]在生物样品中诊断由非传统性可传播性因子导致的可传播性亚急性海绵状脑病的方法

说明书

本发明涉及通过检测PrP-res诊断由非传统性可传播性因子(UTA)毒株所引起的可传播性亚急性海绵状脑病(TSSE)的方法，也涉及它在生物样品中对不同的非传统性可传播性因子(UTA)毒株进行鉴别诊断的用途。

可传播性亚急性海绵状脑病(TSSEs)是由非传统性可传递因子(UTAs)即朊病毒所引起的，迄今为止，朊病毒的准确性质尚难确定。基本上可传播性亚急性海绵状脑病可包括人克-雅病(CJD)，绵羊和山羊的瘙痒病，牛海绵状脑病(BSE)。其他脑病已经被证明存在于猫科动物、水貂、以及某些野生动物如鹿或驼鹿中。

这些疾病总是致命的，并且现在无有效的治疗方法。

在可传播性亚急性海绵状脑病中，宿主蛋白质PrP(或朊病毒蛋白)以异常形式(PrP-res)主要蓄积在中枢神经系统。PrP-res与感染性共纯化，它的蓄积出现于组织学损害之前。体外培养发现，PrP-res对神经细胞的培养具有毒性作用。

朊病毒蛋白的二种同工型具有相同的氨基酸序列(见图1)，但它们的二级结构不同。PrP-res具有更多的β-折叠片层，而正常PrP(PrP-sen)含有更多的α-螺旋。

一般可以利用两种生化性质识别这二种同工型。

—PrP-res对蛋白酶有部分抗性，蛋白酶K可引起其N-末端的裂解。使用蛋白酶K处理之后，PrP-res通常根据其双糖基化形式的表观分子量而被称作PrP27-30。一般公认对于传统毒株，切割位点位于89和90氨基酸之间(Prusiner等，Cell，1984)。

-PrP-res不溶于非离子去污剂，例如Triton X100和Triton 114。

正常形式的朊病毒蛋白(PrP-sen)原则上可被蛋白酶完全降解，而且完全溶于非离子去污剂。

仓鼠、人、牛及羊的PrP-sen多肽序列如图1所示。它们都特别地具有一种八肽基序(P(H/Q)GGG(-/T)WGQ)，根据物种的不同，分别重复出现4或5次。八肽基序重复对应于PrP-sen的第51位至91位氨基酸(按人的PrP序列编号)(B.Oesch等，1991)。

为了检测感染性因子的存在，最新的方法是通过利用其对蛋白酶的部分抗性，根据对连接到感染性因子的异常PrP(PrP-res)进行选择性检测而进行的。

以下方法可能用于识别：

—Western印迹：它基于对组织提取物中的PrP-res进行免疫学检测。在用蛋白酶处理提取物以破坏朊病毒蛋白的正常同工型(PrP-sen)之后，电泳分离提取物中的蛋白质，将其转移到聚合物膜上，使用能够识别朊病毒蛋白的特异抗体进行检测(Schaller O.等，1999)。

—ELISA类试验：也需使用蛋白酶处理提取物。

在这些不同的试验中，需使用蛋白酶处理组织提取物的试验，可以提及：

—Serban等人(Neurology，1990，40，110)描述的方法，他发展了检测PrP-res的方法，包括在硝酸纤维素膜上固定蛋白质，继而用蛋白酶消化，变性及用单克隆抗体进行免疫检测。

—Oesch等人(Biochemistry，1994，33，5926-5931)描述的方法，他提出对PrP-res进行定量，用免疫过滤法(ELIFA或酶联免疫过滤试验)纯化PrP-res。

—Gratwohl等人1997年描述的方法，他们提出使用ELISA型试验。用蛋白酶K处理样品之后，用离心沉淀法纯化PrP-res，将纯化的蛋白吸附在微量滴定板上，使用兔多克隆抗体进行检测。

—Safar等人1998年描述的方法，他不使用蛋白酶K处理样品，但基于其是否遭受变性处理比较了固定在固相支持物上的PrP-res的免疫反应性。

总的来说，上述这些各种不同的方法具有缺乏敏感性和因此造成假阴性的缺点。

其它方法建议使用变性物质处理样品(Oesch等，1994和1999；WO 00/22438，加利福尼亚大学制剂)：用蛋白酶K有限处理样品(WO 00/29850，Wallac Oy等)和用金属肽酶处理样品(WO 00/22438)，使隐蔽的抗原位点暴露，这些位点可以用单克隆抗体3F4进行检测，它识别朊病毒蛋白109-112区域(WO 00/29850或WO 00/22438)。