[发明专利]酶底物,合成方法和用途

说明书

本发明涉及新的一族酶底物及其用途，特别是检测微生物的用途。

细菌的检测和鉴定在药物或食品工业中是非常重要的，因为已知这种生物体不仅证明是病原体，而且也造成某些类型的污染。

最近为此目的开发的方法利用有色或荧光化合物的应用，并且例如在M.Manafi等人的综述“微生物学综述”(Microbiological Reviews)55(3)，pp.335-348，1991或者更近一些时候M.Manafi的De Ware(n)Chemicus，28，pp.12-17，1998中已经描述的这些化合物的应用。

一般能够分为四组化合物：

-荧光标记物，例如吖啶橙，该标记物吸附到微生物细胞的核酸上或者蛋白质上时，其产生荧光的增强；

-pH-依赖性指示剂，例如吖啶或者7-羟基香豆素，其强度或颜色范围或荧光根据pH而不同，因此根据微生物的生物化学活性而不同；

-对介质的氧化还原性质敏感的化合物，例如亚甲蓝，其在还原介质的作用下产生颜色；

-酶的有色或荧光底物，在对一种微生物或一族微生物特异性的酶存在下在水解作用下，其分别产生颜色或荧光。

在后一种类中已经描述过一些特别使得检测β-D-葡糖苷酶或者β-D-半乳糖苷酶的底物，其是微生物特别是肠杆菌科的重要的taxinomic标记物。这些底物中，可以提到水解后产生黄色邻-硝基苯酚的邻-硝基苯基衍生物，或者荧光底物，例如荧光素的衍生物或者4-甲基7-羟基香豆素的衍生物，它们产生荧光标记。这些底物相当大的限制性是扩散到培养基中的现象，这使得更难以区别菌落和本底噪声。

为了解决这一问题，曾使用过其它在水解之后产生不溶产物的底物。这些底物处于细菌菌落周围而不扩散到培养物载体上，这有利于实验的说明。

在这些底物中，已经开发了3-吲哚氧基衍生物(参见例如Kodaka等，临床微生物学杂志(J.Clin Microbiol.)33，p.199-201，1995或者专利US5358854和US5364767)或者6，7-二羟基香豆素衍生物(参见例如WO97/41138)。首先，困难的合成大大提高了费用，限制大规模工业应用的发展，另外，这些底物对培养基温育条件敏感。第二，为了发生颜色反应而向培养基中加入铁-基复合物试剂的必要性对于某些微生物是一个问题，因为其可以干扰它们的代谢，特别是干扰所研究的微生物。

本发明描述了没有上述缺陷的新的一族酶底物，因为这些化合物的合成操作简单，这些底物在水解之后不溶解，它们不扩散到培养基中并且它们不需要加入复合物试剂例如铁或者任何特殊的氧化还原条件。

本发明的一个目的是描述一类通式(I)的化合物：

其中

X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任选地被间位或对位取代，

当X代表碳原子时，Y和Z代表氢原子，或者Y和Z一起代表任选被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺键，

R₁和R₂各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R₁和R₂一起代表可以被取代或者没有被取代的稠合的苯环，

R₃和R₄各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，

R代表一个基团使得O-R键能够被酶水解。

本发明中感兴趣的酶是其存在提供了检测和/或鉴定和/或定量一种或多种微生物或者分析物的信息的酶，例如蛋白质，肽或核酸。特别地，所述酶来自osidases家族，例如β-葡糖醛酸酶，β-半乳糖苷酶，6-磷酸半乳糖水解酶，α-半乳糖苷酶，α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，或者氨基己糖苷酶，例如N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶或者N-乙酰基-β-氨基半乳糖苷酶，或者来自酯酶家族，脂酶家族，磷酸酯酶家族，硫酸酯酶家族，DNA酶家族，肽酶家族和蛋白酶家族。优选地，所述酶来自osidases家族，例如β-D-葡糖苷酶，β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶，或者来自硫酸酯酶家族，磷酸酯酶家族或酯酶家族。

选择R基团作为要检测的酶的官能团。R是例如α-或β-糖型残基，例如木糖，葡萄糖，半乳糖，葡糖醛酸或氨基葡糖的衍生物，或者磷酸根，硫酸根，或者其中R₆是具有1-16个碳原子的烷基的羧酸根(R₆COO-)，核苷酸或肽。优选地，R基团是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖，β-D-葡糖醛酸根，磷酸根，硫酸根或乙酸根。