[发明专利]石斛的DNA序列及利用该序列鉴定其品种或辨别其真伪的方法

说明书

本发明涉及贵重中药的DNA序列及利用该序列鉴定其品种和辨别其真伪的方法，更具体地说，本发明涉及中药石斛的ITS2及5.8S和28S核糖体部份DNA序列及利用该序列鉴定其品种或辨别其真伪的方法。

石斛为贵重中药材，应用历史悠久，在《神农本草经》中列为上品，具有滋阴消热、生津益胃、润肺止咳等功效，用于热病伤津、口干烦渴、病后虚热等多种病症。现代药理研究表明，石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力及扩张血管的作用。因此石斛在临床上及复方中药制剂中被广泛应用。中国药典(1995年版)收载有5种石斛，即金钗石斛(D.nobile Lindl.)，铁皮石斛(D.candidum Wall.ex Lindl.)，束花石斛(D.chrysanthum Wall.ex.Lindl.)，美花石斛(D.loddigesii Rolfe)和流苏石斛(D.fimbriatum Hook)。

石斛药材的市场需求量甚大，每年达数千吨之多，而部份商品的售价昂贵，例如一级石斛(Herba Dendrobii)每公斤的售价达3500美元。

市售石斛的来源复杂，涉及石斛属植物30多种，并时有其他属的兰花(如石仙桃属)混作石斛药材使用，直接影响到石斛的临床疗效及消費者的利益。再者，石斛药材的原植物均是濒危品种，如铁皮石斛列于中国受保护植物名录的第III类级别。

现行的石斛鉴定方法包括性状鉴别、化学分析及微观解剖。但这些方法仍未对药典所列的石斛品种作全面和客观的鉴定。

植物核糖体脱氧核糖核酸(rDNA)以順反子18S-ITS1-5.8S-ITS2-26S的形式存在。植物大多拥有该順反子的重复序列，其以头尾相连的方式聚集在染色体上。目前研究显示，18S、5.8S和26S等rDNA基因的碱基对序列非常保守，不同植物间的差别很小；而位于植物rDNA基因之间的ITS1(转录空隙区1)和ITS2(转录空隙区2)的碱基对序列则差别较大。同时由于基因转化和交换的作用，就同一品种植物而言，其rDNA序列大致相同(Hillis和Dixon，1991)。

因此，本发明的目的是提供石斛药材的ITS2及5.8S和28S核糖体部份DNA序列。

本发明的另一个目的是提供利用所述DNA序列鉴定石斛的品种及辨别其真伪的方法。

为达到本发明的目的，本发明人从香港及中国大陆的不同地点收集了46种样品，包括16种石斛和一种石仙桃。所有的样品均经过兰科专家鉴定。除了罗河石斛之外，其余每一品种都有从数个不同群体获得的样品。所测得的46个样品的ITS2及5.8S和28S核糖体部份DNA序列如下：

1.钩状石斛(Dendrobium aduncum Lindl.)样品1的ITS2及5.8S和28S核糖体部分RDNA序列：

AACCATCG AGTCTTTG AACGCAAG TTGCGCCC GAGGCCAA

CCGGCTAA GGGCACGT CCGCCTGG GCGTCAAG CATTTTAT

CGCTCCGT GCCTAATC TCCCATCC ATGTATGT GTTGCAAA

GGCTCGGA TGTGCACG GTGGCTCC TCGTGCCC CTTGGTGC

GGCGGGCT GAAGGCCG GGTCATCT TCTCGTTG GTTGCCAA

CAATAAGG GGTGGATT AAACAAGG CCTATGCT GTTGTGAT

ATGCGCGC CCGAGAGA TGATCATA CTTTTTAG GTGATCCC

AATTCATG CGCTGATC CATGGATG GCGTATCG AATGCGAC

CCCAGGAT GGGCGAGG CCACCCGC TGAGTTTA AGCATATC

AATAAGCG GAGGAAAA GAAACTTA CGAGGATT CCCCTAGT

AACGGCGA GT

2.钩状石斛(Dendrobium aduncum Lindl.)样品2的ITS2及5.8S和28S核糖体部份rDNA序列：

AAC CAT CGA GTC TTT GAA CGC AAG TTG CGC CCGAGGCC

AACCGGCT AAGGGCAC GTCCGCCT GGGCGTCA AGCATTTT

ATCGCTCC GTGCCTAA TCTCCCAT CCATGTAT GTGTTGCA