[发明专利]衍生自牛脑的膜结合鞘磷脂酶,其分离方法和抗鞘磷脂酶单克隆抗体

说明书

本发明涉及膜结合的，中性pH最适的鞘磷脂酶，其分离方法，和针对它的单克隆抗体。

作为信号转导中的二级递质，神经酰胺涉及不同的细胞反应，包括细胞分化，细胞周期中止，细胞老化，凋亡等。神经酰胺的产生是鞘磷脂，一种膜磷脂水解的直接结果。

鞘磷脂酶(SMase)的功能是将鞘磷脂水解成神经酰胺和磷酸胆碱，其已发现的同工酶有：脂质体酸性pH最适SMase(A-SMase)；细胞质，Zn-依赖性酸性pH最适SMase；碱性pH最适SMase；细胞质，Mg²⁺-依赖性中性pH最适SMase(N-cSMase)；和膜结合，Mg²⁺-依赖性，中性pH最适SMase(N-mSMase)。已知A-SMase和中性型SMase响应胞外刺激，如1α，25-二羟基维生素D₃，肿瘤坏死因子-α，白细胞介素-1β，神经生长因子，化疗药物，血浆耗竭等，提高胞质神经酰胺的浓度。

最近，已分离了衍生自人尿的酸性pH最适的SMase，并成功克隆了编码该酶的cDNA(Quintern，L.E.等，EMBO J.，8，2469-2473(1989))。本发明人也分离一种胞质75kDa N-cSMase，并确定了它的特征，该酶的活性依赖于Mg²⁺，并对谷胱甘肽和DTT敏感，其内容正在申请专利(韩国专利申请号98-28187)。

当时，大部分N-mSMase还未被完全确定特征，因为它们的高疏水性，非常难于分离。尽管有这些困难，还是从哺乳动物细胞中克隆了一种分子量为47.5kDa的N-mSMase(Tomiuk，S.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，3638-3643(1998))。然而，该N-mSMase虽然是一种膜结合蛋白质(可用Triton X-100解离)，但是被说成和TNF-α信号转导途径并无关系。用Triton X-100还从大鼠脑中成功分离了另一种N-mSMase，但是一种部分纯化的形式(Liu，B.，等，生物化学杂志，273，34472-34479(1988))。报道该部分纯化的N-mSMase的活性被谷胱甘肽(酶活性被抑制了50％的浓度(IC₅₀)：2.5mM)抑制，并被DTT和磷脂酰丝氨酸促进。本发明人成功的从牛脑中完全分离了两组新的N-mSMase：一组分子量为35kDa，由4个同工酶构成(T-mSMase A、B、C和D)，使用Triton X-100分离；另一组分子量为40kDa，由两种同工酶构成(S-mSMase I和II)，使用硫酸铵分离，所有的酶都确定了特征，正在申请专利(韩国专利申请号98-28187)。

特别是，据信脑组织中存在的N-mSMase在脑病原学中起了重要作用，因为脑组织中神经酰胺介导的信号转导途径导致神经细胞死亡，导致帕金森病和阿耳茨海默病，少突胶质细胞、PC12细胞和T9细胞的凋亡，所有都与低亲和性神经营养蛋白受体(p75NTR)的介导、TNF-α导致的少突胶质细胞凋亡，和某些中枢神经系统疾病，如缺血性脑损伤的病理学有关。

                            发明简述

因此，本发明的一个目的是提供一种从牛脑分离的，膜结合的，中性pH最适的鞘磷脂酶，它可用于开发大脑疾病，如帕金森氏病、阿耳茨海默病等的治疗剂。

本发明的另一个目的是提供一种从牛脑制备该鞘磷脂酶的方法。

本发明的另一个目的是提供一种鞘磷脂酶特异性的单克隆抗体。

根据本发明的第一个实施例，提供了一种衍生自牛脑神经元膜的鞘磷脂酶，它的分子量为60kDa，活性依赖于Mg²⁺，最适pH范围是6.0-9.0。

根据本发明的第二个实施例，提供了一种根据本发明分离鞘磷脂酶的方法，包括步骤：对牛脑组织匀浆，并离心匀浆，以除去细胞碎片和核；从上清液将细胞膜通过离心分离出来，成为沉淀；用含有硫酸铵的缓冲液处理细胞膜，以从膜解离出鞘磷脂酶；对抽提液进行阴离子交换层析；在含有Triton X-100的缓冲液中超声层析组分，并离心超声的组分，获得含有鞘磷脂酶的上清液；并对上清液按照确定顺序进行疏水作用层析，阴离子交换高效液相层析，疏水作用高效液相层析，和阳离子交换快速蛋白质液相层析，以纯化鞘磷脂酶。

根据本发明的第三个实施例，提供了一种由杂交瘤SM1A5(保藏号KCLRF-BT-00025)产生的针对鞘磷脂酶的单克隆抗体。

                             附图简述