[发明专利]鲎素肽在制备抗肝癌药物中的应用

说明书

本发明涉及一种含肽物质在医用配制品中的用途，尤其是鲎(horsoshve crab)素肽在制备抗肝癌药物中的用途。

鲎(horseshoe crab)是一种进化地位特殊的“活化石”。自古生代奥陶化出现以来，其形态结构没有发生重大变化，经4亿多年漫长的沧桑岁月的物竞天择，其蓝色血液中仍然蕴藏着丰富的功能特殊的生物活性物质。自Levin和Bang利用鲎血细胞溶解物检测微量细菌内毒素，建立鲎试剂试验法以来，鲎血液天然活性物质研究一直受到美日等国学者的高度重视。目前已从美洲鲎(Limulus polyphemus)和东方鲎(Tachupleus tridentatus)的血液中分离得到具有强烈抗菌、抗病毒，尤其是抗艾滋病毒活性的鲎素(tachuplesins)。自1988年日本学者Nakamura T从东方鲎分离提取鲎素以来，鲎素的研究引起人们的广泛关注(Nakamura T et al.Tachyplesin,a class of antimicrobial peptide from the hemocytes ofthe horseshoe crab(Tachypleus tridentatus).J.Biol.chem.,1988,263(32):16709～16713)，鲎素是一种分子量为2.3KD带阳离子的肽类，它在鲎血细胞中定位于小颗粒中。利用Edman降解法测量其组份表明，鲎素肽由17个氨基酸组成，除了2个双硫桥外，其羧基端带有1个α-精氨酰胺，其氨基酸序列为

本发明旨在提供鲎血细胞提取物——鲎素肽(以下简称T-1)在制备抗肝癌药物中的应用。

本发明所说的T-1其氨基酸序列如式(1)所示，结构图见图1，除2个双硫桥外，其羧基端带有α-精氨酰胺，其中C为半胱氨酸，F为苯丙氨酸，G为甘氨酸，I为异亮氨酸，K为赖氨酸，R为精氨酸，V为缬氨酸，W为色氨酸，Y为酪氨酸。T-1以3个4肽单位相互连接形成环状结构，中间两个由半胱氨酸形成双硫桥。鲎素肽可作为有效活性组份用于制备抗肝癌药物。

作为有效活性组份用于制备抗肝癌药物的T-1可由鲎血细胞中分离提取，其方法如下：

1)鲎血细胞的分离提取：采鲎血，收集鲎血细胞备用。

2)鲎血细胞酸抽提液制备：

将鲎血细胞悬浮于缓冲液匀浆，然后离心弃上清液，所收集的沉淀用同一缓冲液洗两次。洗涤后的沉淀悬浮于HCL中匀浆。匀浆液再离心，收集上清液。沉淀用HCl重抽提，同样收集上清液，最后弃去沉淀。3次收集的上清液即为所需的鲎血细胞酸抽提液。低温保存备用。

3)T-1的分离：

将所得的鲎血细胞酸抽提液经凝胶过滤，用HCl溶液洗脱，再用核酸蛋白检测仪收集在280nm处记录图形。收集第Ⅲ个峰，即为T-1。

4)T-1的纯化：

选用阳离子交换剂对T-1作进一步纯化。用缓冲液洗脱。核酸蛋白检测仪收集并在280nm处记录。收集最后一个峰则为纯化的T-1。将收集的T-1冷冻干燥，所得干粉低温保存备用。

根据经T-1处理的人肝癌SMMC-7721细胞的生长曲线测定、分裂指数观察、软琼脂培养细胞集落形成观察；T-1对碱性磷酸酶(AkPase)、乳酸脱氢酶(LDH)、ATP酶、C-erB-2、P⁵³基因表达的影响；T-1对细胞形态和超微结构的影响，以及T-1对荷瘤裸鼠实体瘤的抑制作用的研究表明，T-1对肝癌细胞有显著的诱导分化的抗肿瘤作用。

图1为T-1的结构图。

图2为人肝癌SMMC-7721细胞生长曲线图，(a)为对照组；(b)为经T-1处理。

图3为人肝癌SMMC-7721细胞分裂指数图，(a)为对照组；(b)为经T-1处理。

图4为T-1对人肝癌SMMC-7721细胞碱性磷酸酶(AkPase)的影响，(a)为对照组；(b)为经T-1处理。

图5为T-1对人肝癌SMMC-7721细胞形态和超微结果影响，(a)、(c)、(e)为对照组；(b)、(d)、(f)为经T-1处理。(a)细胞核畸形、核中异染色质多，胞质细胞器结构异常；(b)细胞形态正常，核中常染色质丰富，胞质细胞器丰富，形态正常；(c)SMMC-7721球形细胞，细胞表面微绒毛较多；(d)T-1处理后，球形细胞表面微绒毛减少；(e)SMMC-7721扁平铺展细胞，细胞表面微绒毛较丰富，片状伸足较少；(f)T-1处理后扁平铺展细胞表面微绒毛减少，片状伪足增多。

图6为鲎血细胞酸提取物过Sephadex G-50柱的凝胶过滤曲线图。