[发明专利]一种新的多肽——烯醇丙酮酸磷酸依赖的糖磷酸转移酶13.75和编码这种多肽的多核苷酸

说明书

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多肽——烯醇丙酮酸磷酸依赖的糖磷酸转移酶13.75，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的制备方法和应用。

烯醇丙酮酸磷酸依赖的糖磷酸转移酶系统(PTS)是细菌中一个主要的糖运输系统。该系统在调节全局多种代谢途径中起到至关重要的作用，同时也涉及到许多代谢和翻译过程的调控。它由两个参与能量代谢的蛋白质-酶I(EI)和热稳定的磷酰基载体蛋白(HPr)，以及糖特异性通透酶---酶II复合物组成。PTS能催化糖的运输转膜过程及伴随的糖磷酸化过程。在不同种类的大肠杆菌中，PTS通透酶由不同数量的多肽链组成。在特定情况下，一些糖特异性蛋白会融合形成有EI和/或HPr能量偶联功能的结构域。有证据表明，整个EII复合物是糖运输和磷酸化过程所必需的。

对通透酶的序列进行比较，揭示了大多数的PTS通透酶是同源的，可以说是从同一个祖先蛋白衍生而来，它们的折叠几乎相同。通过比较EII复合物的主要基团，这些基团具有相似的分子量，大约为68000，对应于635个氨基酰残基。它们中的大多数不是由一个单独的多肽链-(通常称为EII)，就是由两个蛋白对(EII与EIII对或EIIA与EIIB对)所组成。在一些特例中，通透酶由三或四个蛋白组成。不管在每个通透酶中的多肽链的数目，通透酶至少有三个易于识别的功能结构域：疏水性转膜结构域，能结合并运输糖底物；亲水性EIII类似结构域，拥有第一个磷酸化位点(始终是组酰胺)；第二个亲水性蛋白或蛋白结构域，拥有第二个磷酸化位点。该位点或者是对应于大多数的同源PTS通透酶的半胱酰胺残基，或者是下述三种通透酶的组酰胺残基。这三种通透酶分别催化在E.coli中甘露糖、B.subtilis中果糖和K.pneumoniae中山梨糖的运输和磷酸化。这三者缺乏足够与其它大部分通透酶相似的序列，而建立同源性，但是它们之间有清晰的同源关系。在不同的通透酶之间的序列比较揭示了在它们的进化过程中，不同的疏水性和亲水性的结构域以不同的顺序相互融合以及互相重组或结合而形成独特的多肽链。在一些情况下，通透酶之间的序列类似程度无论对一个特定的通透酶复合物的整体或部分来说，都不足以构成同源性。

EII被认为是PTS的重要组成蛋白，参与了跨膜，形成膜转移通道和提供糖结合位点。EII通常由两个细胞质结构域IIA、IIB和一个转膜的结构域IIC组成。其中IIA含有第一个通透酶特异性的磷酸化位点，该位点是一个组氨酸，可被磷酸化的HPr磷酸化。IIB含有第二个磷酸化位点，是依赖于通透酶而被磷酸化的IIA所磷酸化。最后磷酰基从IIB被转移到作为底物的糖上。在一些通透酶中，IIA和IIB之间可以通过一个富含丙氨酸和脯氨酸的多肽相连，形成一个稳定的二聚体结构IIAB。IIA的二级结构通常是一个有五条链所组成的反平行的β-折叠并在其两端带有螺旋的结构。作为磷酸化位点的组氨酸位于第三条β折叠链末尾的由疏水性残基所组成疏水表面的浅裂缝中。此外在作为磷酸化位点的组氨酸附近(大约靠近N端的15个氨基酸位置)处还有一个组氨酸存在，它在IIA被磷酸化以后，也能与磷酰基团相互作用。对于整个EII酶来说，磷酸化前与磷酸化后的结构变化差异是比较小的。

该酶的特征性同源序列是：

1.G-x(2)-[LIVMFA]-[LIVMF](2)-H-[LIVMF]-G-[LIVMF]-x-T-[LIVA]

其中H被磷酸化

2.[DENQ]-x(6)-[LIVMF]-[GA]-x(2)-[LIVM]-A-[LIVM]-P-H-[GAC]

其中H被磷酸化

通过基因芯片的分析发现，在正常脑、肝癌、肌肉、胎脑、胎肾，胎肺、胎肝、甲状腺、胸腺、成人肝、肺、胶质瘤中，本发明的多肽的表达谱与烯醇丙酮酸磷酸依赖的糖磷酸转移酶的表达谱非常近似，因此二者功能也可能类似。本发明被命名为烯醇丙酮酸磷酸依赖的糖磷酸转移酶13.75。

由于如上所述烯醇丙酮酸磷酸依赖的糖磷酸转移酶13.75蛋白在调节细胞分裂和胚胎发育等机体重要功能中起重要作用，而且相信这些调节过程中涉及大量的蛋白，因而本领域中一直需要鉴定更多参与这些过程的烯醇丙酮酸磷酸依赖的糖磷酸转移酶13.75蛋白，特别是鉴定这种蛋白的氨基酸序列。新烯醇丙酮酸磷酸依赖的糖磷酸转移酶13.75蛋白编码基因的分离也为研究确定该蛋白在健康和疾病状态下的作用提供了基础。这种蛋白可能构成开发疾1病诊断和/或治疗药的基础，因此分离其编码DNA是非常重要的。