[发明专利]一种新的多肽——人二氢吡啶二羧酸脱氢酶9.46和编码这种多肽的多核苷酸

说明书

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多肽——人二氢吡啶二羧酸脱氢酶9.46，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的制备方法和应用。

二氢吡啶二羧酸脱氢酶(DHDPS)催化赖氨酸以及二氨基庚二酸生物合成的第一个反应步骤。DHDPS通过乒乓机制催化天门冬氨酸半醛和丙酮酸的浓缩，在这个机制中，丙酮酸和一个赖氨酸残基首先形成一个西佛碱与酶结合，然后结合天门冬氨酸半醛。有其它三个蛋白在结构上与DHDPS相关，而且很可能以同一个接触反应的机制起到作用：1.大肠杆菌N-乙酰神经酰胺裂合酶(gene nanA)，催化N-乙酰-D-甘露糖胺和  丙酮酸的浓缩合成N-乙酰神经酰胺。2.根瘤菌的草木犀蛋白mosA，与根霉促进素3-氧-甲基-scyllo-肌胺霉的生物  合成相关。3.大肠杆菌推测蛋白yjhH。

已经替这些酶确认了两种信号模式。第一种是以蛋白N末端的高度保守区域为中心的。第二种信号包含一个大肠杆菌中二氨基庚二酸合成时的赖氨酸残基，作为形成西佛碱的反应物。

二氢吡啶二羧酸脱氢酶在高等植物和很多细菌中(二氨基庚二酸基因genedapA)都存在，是赖氨酸以及二氨基庚二酸生物合成的第一个反应步骤。

大肠杆菌二氢吡啶二羧酸脱氢酶是赖氨酸生物合成特异的，以乒乓机制催化丙酮酸和天门冬氨酸β-半醛(ASA)的缩合。丙酮酸首先和赖氨酸的ε-氨基酸基团结合形成西佛碱，与酶结合，然后结合ASA。K_m在0.57-0.55mM之间，决定于丙酮酸和DL-ASA。3-溴-丙酮酸在K_i是1.6mM时抑制DHDPS，DHDPS活性仅50％。1.0mM的L-赖氨酸，1.2mM的吡啶二羧酸钠或4.6mM的S-2-氨乙基-L-半胱氨酸都抑制DHDPS活性。

小麦的DHDPS和大肠杆菌的DHDPS有30％同源，其中一个克隆的cDNAs已与E.coli的DHDPS转录和翻译信号融合，E.coli的基因互补链缺乏内源DHDPS活性。而且，野生E.coli中小麦DHDPS cDNA的表达在转化的细菌中使酶的活性增强10倍。

另一个与gene dapA相关的基因是根瘤菌的草木犀L5-30基因群位点，编码根霉促进素3-氧-甲基-scyllo-肌胺霉，是一个镶嵌结构。此基因位点群由安排了一个操纵子(ORF1和MosABC)的四个读框组成。在这个位点中，存在几个具有其它原核共生基因(nifH，fixA，fixU，和nifT)的几个同源基因域，据此推测这个位点可能表现一个共生基因重排的热点。通常这些基因域在基因群位点的编码和非编码区域都存在。MosABC而不是ORF1启动的基因编码的蛋白通过抗体在结瘤抽提物中发现。因为ORF1显示出与nifH基因的5’端和一个移码突变具广泛的同源说明这个读框的表达不需要位点的活化，实验者推测这个基因群位点获得了一个nifH的复制文本，包括进行共生调节的启动子。令人惊讶的是，尽管看上去结构不同，MosA有一段与大肠杆菌的DapA蛋白序列相似的氨基酸序列。MosB的中心区域和一组不同的蛋白有广泛的同源，这些蛋白在抗菌或细胞外生物合成上与糖代谢有关。这些区域在调节蛋白DegT和DnrJ上是共有的，据认为是MosB的一个调节位点。MosC的结构是与其作为一种膜转运蛋白一致的。

由于二氢吡啶二羧酸脱氢酶是生物合成赖氨酸和二氨基庚二酸所必需的酶，因此对于研究和治疗赖氨酸缺乏症有重要作用，同时对于研究生化代谢途径中赖氨酸及其衍生物和二氨基庚二酸的作用也有帮助。

由于DHDPS催化丙酮酸和ASA缩合的反应，而赖氨酸要参与其中，可以利用这个反应的进行程度推测肽链中赖氨酸的含量。

通过基因芯片的分析发现，在正常脑、肝癌、肌肉、胎脑、胎肾，胎肺、胎肝、甲状腺、胸腺、成人肝、肺、胶质瘤中，本发明的多肽的表达谱与人二氢吡啶二羧酸脱氢酶的表达谱非常近似，因此二者功能也可能类似。本发明被命名为人二氢吡啶二羧酸脱氢酶9.46。

由于如上所述人二氢吡啶二羧酸脱氢酶9.46蛋白在调节细胞分裂和胚胎发育等机体重要功能中起重要作用，而且相信这些调节过程中涉及大量的蛋白，因而本领域中一直需要鉴定更多参与这些过程的人二氢吡啶二羧酸脱氢酶9.46蛋白，特别是鉴定这种蛋白的氨基酸序列。新人二氢吡啶二羧酸脱氢酶9.46蛋白编码基因的分离也为研究确定该蛋白在健康和疾病状态下的作用提供了基础。这种蛋白可能构成开发疾1病诊断和/或治疗药的基础，因此分离其编码DNA是非常重要的。