[发明专利]乙肝病毒前S1抗体酶免测定试剂盒及制备方法

权利要求书

1、一种乙肝病毒前S₁抗体酶免测定试剂盒，其特征在于该试剂盒是由预包被反应条，酶结合物工作液、阳性对照物、阴性对照物、样品稀释液、浓洗涤液、显色剂A、显色剂B和终止液组成的。

2、一如权利要求1所述的一种乙肝病毒前S₁抗体酶免测定试剂盒的制备，其特征在于该方法是：(一)基因工程前S1抗原的制备(1)前S1 DNA序列 1       10         20       30        40        50       60 MGGWSSKPRKEMGTMLSYPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPVKDDWPAANQVGVGA

  70         80        90          100       110 FGPRLTPPNGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQA(2)材料：HBV由军科院五年四室提供，PCRKit、限制性内切酶，T4DNA连接酶购自上海华美公司，GST，还原型4B购自Sigma公司，上海基康公司合成上游引物5′-CGGATC-CATGGGAGGTTGGTCTTCCA，下游引物5′-GC-GATTTCCTAGTGGAATGTTGTGGAGT，(3)方法：反应在Progene公司PCR合成仪上进行，反应条件为94℃30s，60C 30s，72℃ 30s，35个循环，PCR产物由基康公司测序，(4)表达和纯化：将PCR产物用BamH I和EcoR I酶切，在1％琼脂糖凝胶上电泳回收387bp的片段，与相同酶切的载体pGEX-4T-1连接，转化大肠杆菌HB101株，诱导用IPTG，终浓度1mmol/L，SDS-PAGE分析结果，按Sepharose 4B说明书纯化表达融合蛋白产物，采用间接ELISA法检测前S1抗体，(二)SPA-HRP的制备(1)称5mg辣根过氧化物酶(HRP)加0.5ml蒸馏水，再加0.5ml 60mM过碘酸钠氧化15′4℃中，(2)加0.16M乙二醇0.5ml中止氧化4℃ 30′(3)加10mg/ml纯SPA0.5ml，装袋对碳酸钠缓冲液过夜，(4)取出袋内液体，加5mg/ml硼氢化钾0.2ml，4℃3h再装透析袋对PH7.2 0.01M PBS透析24h换液4-5次，(5)取出SPA-HRP作活性和效价测定(三)阴性对照血清配(1)用本试剂盒检测正常人血清30份，混合A450＜0.1的血清，(2)上述混合血清加等量小牛血清后再检测一次，确定A450＜0.1，(3)混合血清中加2/万叠氮钠，过滤分装-20℃中保存，(四)阳性对照血清配制(1)取兔抗前S1抗血清作ELISA前S1抗体效价测定；取A450＞2.0的滴定效价的2倍浓度为阳性对照血清，(2)取该浓度抗血清加等量小牛血清再做ELISA测定A450＞1.5(3)上述阳性血清中加2/万叠氮钠，过滤分装，-20℃中保存，(五)底物缓冲液配制1、甲液(1)各称磷酸氢二钠18.4克，柠檬酸5克，PM50mg，放入容量瓶中加双蒸水至1000ml，搅拌溶解后再加30％双氧水400ul，(2)过滤除菌后分装小瓶2、乙液(1)称EDTA 150mg加入1000ml双蒸水中，加热溶解，(2)上液冷却后加柠檬酸1.05克，再加用二甲亚砜溶解的TMB250mg，(3)分装入黑色小瓶中，(六)本发明乙肝病毒preS1抗体酶联免疫测定方法的建立，(1)用20mM Tris-Hcl液将纯前S1抗原稀释为5ug/ml浓度，各反应孔中加0.1ml，置4℃中24h，弃去上清液，拍干，(2)在试管中将待检血清用蒸馏水(或生理盐水)作1∶25稀释，(3)各孔中滴加1滴样品稀释液，然后分别加1∶25稀释的待检血清50ul，同时做阳性对照孔和阴性对照孔，(4)置37℃温箱中反应25分钟后，甩去孔内液体先在草纸上拍2-3下，然后用洗涤液洗5次，每次条孔加满洗涤液后停留30秒种，每次甩去孔中液体后都要在草纸上拍干，以便彻底洗涤，(5)各孔加2ug/mlSPA-HRP结合物50ul，37℃反应25分钟，(6)同上彻底洗涤拍干，(7)各孔滴加底物缓冲液甲、乙各1滴，置37℃中反应5分钟，再每孔滴加终止液1滴，测A450值，(8)结果判定

阴性对照A值×2.5＝临界值，凡待检标本孔A值＞临界值即为阳性，阴性对照小于0.05时按0.05计算，(七)灵敏度，特异性和精密度试验，1、灵敏度测定(1)阳性血清浓度的定值

在检测前S1抗原实验操作中，能中和1ng/ml前S1抗原最高稀释度血清的抗体定为1u/ml，实际操作时将前S1抗原配成20ng/ml浓度，(2)灵敏度实验

将上述实验中滴定为1280u/ml，160u/ml和40u/ml的3份阳性血清用样品稀释液作不同浓度稀释后，按实验操作方法作灵敏度测定，结果如下：

                   血清抗体效价(u/ml)

血清

      1280  640   320   160   80    40    20    10

1号   ＞2^* 1.65  1.46  0.98  0.74  0.40  0.24  0.17

2号               1.15  0.70  0.46  0.27  0.15  0.06

3号                                 0.45  0.27  0.10

^*A450

测定阴性血清6份，A450分别为0.14，0.06，0.11，0.07，0.07，0.08，阴性平均A450＝0.088，阳性临界值＝0.088×2.5＝0.22，则本检测方法对3份阳性血清的检测灵敏度分别为20u/ml，40u/ml和20u/ml平均为26.7u/ml，2、特异性测定

对用上海长征医学科学有限公司生产的乙肝二对半试剂盒检测五项指标全部阴性的血清共30份，按本实验方法前S1抗体测定，结果如下：  1    2    3    4    5    6    7    8    9    10   11   121 0.06 0.05 0.06 0.05 0.08 0.07 0.10 0.05 0.04 0.11 0.09 0.072 0.10 0.12 0.10 0.07 0.18 0.11 0.13 0.07 0.06 0.10 0.12 0.143 0.12 0.10 0.13 0.09 0.08 0.07

同时用6份小牛血清按实验操作方法测定的A值分别为0.05，0.05，0.08，0.07，0.06，0.09，平均值为0.067，临界值＝0.067×2.5＝0.168，则30份血清中有1份血清为可疑阳性，特异性＝29/30＝96.7％，3、精密度测定

取实验吸光度分别为高中低A值的3份阳性血清做精密度试验，批内试验为每份血清同时做12个复孔，批间试验为每份血清间隔2-3天实验1次，共测定6次，结果如下：

批内试验：   1    2    3    4    5    6    7    8    9    10   11   12   X   S      CV(％)1 1.42 1.37 1.40 1.35 1.37 1.45 1.32 1.40 1.32 1.48 1.30 1.27 1.37 0.0625 4.62 0.74 0.86 0.70 0.81 0.83 0.80 0.72 0.82 0.70 0.85 0.82 0.84 0.79 0.059  7.53 0.26 0.25 0.31 0.27 0.24 0.32 0.25 0.26 0.25 0.25 0.28 0.29 0.27 0.0257 9.5

平均批内CV＝7.2％

批间试验 

  1    2    3    4    5    6    X    S      CV(％)

1 1.45 1.30 1.41 1.38 1.28 1.29 1.35  0.071  5.3

2 0.72 0.86 0.70 0.75 0.84 0.77 0.773 0.0644 8.3

3 0.26 0.21 0.31 0.25 0.28 0.26 0.262 0.033  12.7

平均批间CV＝8.77％。