[发明专利]单核苷酸多态性(SNP)的简便快速的高温杂交芯片检测技术

说明书

本发明是一种涉及基因组DNA芯片高温杂交检测的技术，是指采用特殊高亲和力探针、探针立体网络化固定、目标DNA的直接标记以及高温杂交等技术，提高杂交温度，减少溶液中DNA复性，同时缩短检测时间。该技术可用于单核苷酸多态性和基因突变的检测分析。

人类基因组是一个十分稳定的体系，不同的民族、群体和个体都有46条染色体，有相同数目的基因和基因分布，也有基本相同的核苷酸序列，基因组结构的这种稳定性保证了人类作为一个物种的共同性和稳定性，然而人类基因组又是一个变异的体系。在长期进化的过程中，基因组的DNA序列不断地发生变异，这些变异可能是有害的、有益的或中性的，它们其中的一些被保存下来，导致了不同种族、群体和个体间基因组的差异或多态性。对基因组多态性的了解将有助于阐明基因表型、序列变异与疾病风险之间的关系。一种普遍的多态性是基因组中散在的单个碱基的不同，这种不同虽然也包括单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换，即单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。随着人类基因组计划的进展，人们愈来愈相信基因组中的这类多态性有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性、以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。

SNP是指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中最少一种在群体中的频率不小于1％。由于SNP是二等位基因态(biallelic)的，易于自动化批量检测，因而被认为是新一代的遗传标记。作为DNA序列中单个碱基的置换，理论上任何用于检测单碱基突变或多态的技术都可用于SNPs的识别或检出，例如，RFLP、等位基因特异的寡苷酸杂交、寡核苷酸连接分析(OLA)、等位基因特异的PCR(ARMS)、DNA测序等都可分别用于已知或未知的SNPs的检测。这些方法大多需要电泳和荧光标记。无论为了大量发现新的SNPs，还是用已知SNPs作群体基因型分析，都需要同时检测大量的位点，而上述基于电泳和需标记DNA的方法则因其样本处理费时费力而效率有待提高。为此，近年来已发展了一些批量地、自动化地识别或检出SNPs的方法，如基因芯片技术——即在一块小硅片上进行微阵列分析，让目标DNA与密集的多重寡核苷酸阵列进行杂交以检出SNPs的有效方法。

基因芯片技术已经成为科学研究与临床诊断的重要手段。基因芯片技术是将互补的DNA片段作为探针固定在支撑物的表面，然后与被检测样本中的未知DNA杂交，样本中存在互补DNA序列，即在相应的探针位点产生阳性信号。在现阶段，用于基因突变或多态性检测DNA芯片是寡核苷酸芯片。寡核苷酸芯片是以寡核苷酸作为探针，固定于芯片表面，该寡核苷酸片段，多数为人工合成，用于检测基因突变的探针长度多在8～15个碱基左右。检测时，将相应的DNA片段用PCR进行扩增并标记，然后与芯片杂交，分析杂交位点的信号强度。

迄今为止，基因的点突变以及基因组的单核苷酸多态性的基因芯片检测，主要还是依靠一定长度的寡核苷酸探针对特定序列的识别，需要应用PCR将其特定基因片断扩增并标记，结果PCR扩增技术使被检测的突变位点或特定序列的数量大受限制。而且常规PCR技术将DNA的两条链一同扩增，其PCR产物是双螺旋结果的两条链的混合物，在杂交时由于长时间的杂交，PCR产物自身形成双螺旋结构，而影响了与芯片表面寡核苷酸探针的杂交效率。为了克服此种缺点，不少研究者采用的了不对称PCR技术，不对称性的将基因组DNA中一条链进行扩增，但同时也大大降低的PCR的扩增效率；也有人采用PCR引物标记和分离技术，将常规PCR扩增的产物，通过被标记引物的识别分离而去除互补链以增加杂交效率。这些均增加了操作的复杂性，并延长了检测时间。

因此，到目前为止，用于SNPs和已知基因点突变检测技术还不成熟，或者检测操作太复杂，影响了推广使用。

寡核苷酸芯片用于点突变和多态性的检测还存在以下问题：

1)检测基因组多态性受到很大的限制，由于被检测基因组DNA需要PCR进

  行扩增，因此PCR的操作使被检测基因的数量或突变位点的数量变的非常

  有限；现有的检测基因突变的芯片方法，其同时检测的基因数量不超过5

  个，突变位点的检测数量也在50个以下；

2)PCR操作烦琐，在现有方法检测基因突变的基因芯片方法中，均需要PCR

  对基因进行扩增，有时还需要进行线性(不对称性)PCR扩增，主要是为

  了减少杂交时DNA产物双链之间的退火复性，降低与芯片探针配对的效