[发明专利]一种使用免疫PCR技术的红斑狼疮抗Sm抗体的检测方法

说明书

本发明属于抗体的检测方法。

系统性红斑狼疮(SLE)是常见的自身免疫病。具有累及多脏器，威胁生命，发病率高等特点，但早期治疗却有较高的治愈率或得到有效的控制。

目前诊断SLE的指标有抗dsDNA抗体和抗Sm抗体，抗dsDNA抗体，不仅与SLE的活动有关，而且其他疾病也可以检出，抗Sm抗体可能是一种回忆性抗体，在SLE非活动期也可以检出，是SLE的一种标志性抗体，但检出率低。

现有的抗体Sm抗体检测方法有Western-blot法，CIE法和ELISA法，前两种方法敏感性低，且操作复杂费时，临床应用受到限制，ELISA法特异性强，但敏感性不高。

PCR技术是一种基因检测技术，其原理是模拟DNA体内复制一种体外核酸扩增过程，这种检测技术具有快速、灵敏、特异的特点。1992年PCR技术开始在免疫分析中应用，免疫PCR将抗原抗体反应的特异性与PCR扩增结合在一起成为极为敏感的免疫测定技术。

本发明的目的是建立一种用免疫PCR技术检测红斑狼疮抗Sm抗体的方法，以克服现有的抗Sm抗体检测方法的不足之处。 

本发明的技术方案是利用酶标软板，在每个孔中加入1∶1000～1∶2000(1000U/ml)稀释的SmAg100μl在37℃温度下1～2h，然后用洗涤液洗涤3次，每孔加50μl～200μl封闭液，在25～30℃温度下封闭30min～1h取出后再用洗涤液洗涤3次，每孔加入100μl血清，37℃温育40min，取出后再洗涤3次，之后加入1∶1500～1∶2500稀释的SaHIgG-DNA探针100～200μl，37℃温育45min，取出，再洗涤3～5次，最后加入PCR反应混合物，覆盖70μl石蜡油，在PCR扩增仪上进行扩增，扩增条件为，预变性94℃2min再行94℃40sec，55℃40sec，72℃60sec共35个循环，继续72℃延伸5min，扩增后，取PCR扩增产物20μl加入到2％琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，在紫外反射透射仪上观察结果，照相，同时设PCR阳性对照，同上法进行PCR扩增。

使用本发明的积极效果是：敏感性实验结果表明，免疫PCR方法检测血清抗Sm抗体的敏感性是ELISA方法的10⁷倍。用免疫PCR方法对抗Sm抗体的检出率明显高于ELISA方法(P＜0.05)。用免疫PCR方法检测血清标本抗Sm抗体结果表明，SLE患者血清Sm抗体阳性率为54.9％，而其它自身免疫病患者血清和正常对照血清未见此抗体。因此，免疫PCR方法检测血清抗Sm抗体的特异性强。相关性试验结果表明，免疫PCR方法检测血清抗Sm抗体与ELISA方法呈高度正相关(P＞0.001)。重复性试验结果得到批内和批间CV值分别为2.3～4.8％和3.7～6.95％，表明方法稳定、可靠、重复性好。

本发明的实施例：利用40孔酶标软板，在每个孔中加入1∶1500(1000U/ml)稀释的SmAg100μl在37℃温度下1.5h然后用洗涤液洗涤3次，每孔加100μl封闭液，在25℃温度下封闭45min，取出后再用洗涤液洗涤3次，每孔加入100μl待检血清37℃温育40min，取出后再洗涤3次，之后加入1∶2000稀释的SaHIGg DNA探针150μl，37℃温育45min，取出，再洗涤5次，最后加入PCR反应混合物，覆盖70μl石蜡油，在PCR扩增仪上进行扩增，扩增条件为预变性94℃2min再行94℃40sec，55℃40sec，72℃60sec共35个循环，继续72℃延伸5min，扩增后取PCR扩增产物20μl加入到2％琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，在紫外反射透射仪上观察结果，照相，同时设PCR阳性对照，同上法进行PCR扩增。

本发明所使用的试剂与设备来源是，纯化SmAg(1000U/ml)、抗Sm抗体阳性和阴性血清、SaHIgG-DNA探针、Taq DNA、引物(p21/p23)、琼脂糖、溴化乙锭(EB)均为市场购买。

本发明试剂需经以下配制。

包被缓冲液(PH9.6 0.1mo/L碳酸盐缓冲液)：

Na₂CO₃         4.244g 

NaHCO₃          5.04g

蒸馏水加至       1000ml

PH7.4 0.02mol/L PBS：

NaCL             8g