[发明专利]一种能表达人促生长因子基因的转基因植物的获得方法

说明书

本发明涉及一种能表达人促生长因子基因的转基因植物的获得方法，特别是能表达hEGF基因的转基因植物的获得方法。

目前美容品的美容成分，一般是分别提取人促生长因子如hEGF等和植物中的具美容作用的成分，再将两者混合，工艺复杂，生产成本较高。

本发明的目的是为了克服上述工艺复杂，生产成本较高的缺点而提供一种方法，得到含人促生长因子基因的转基因植物，利用某些具有美容作用的植物如芦荟、胡萝卜、番茄等作生物发生器，在植株内表达具有活性的人促生长因子，同时可利用植物本身的美容成分，从而得到具有良好美容作用的植物提取物，并且方法简单，成本较低。

本发明的目的是这样实现的，先将人促生长因子hEGF基因克隆进puc18质粒，得到hEGF/puc18中间载体，再将该中间载体和pPZP111G质粒再连接组成植物表达载体hEGF/pPZP111G，将该植物表达载体转化到根癌农杆菌中，再用该转化后的根癌农杆菌转化目的植物，经筛选得到能表达人促生长因子hEGF基因的植物细胞株，再由细胞株培养为转基因植物。

用有hEGF/pPZP111G的根癌农杆菌转化芦荟，得到含有hEGF基因的芦荟愈伤组织，再由愈伤组织培育出含hEGF基因的转基因芦荟。

用有hEGF/pPZP111G的根癌农杆菌转化胡萝卜，得到含有hEGF基因的胡萝卜愈伤组织，再由愈伤组织培育出含hEGF基因的转基因胡萝卜。

用有hEGF/pPZP111G的根癌农杆菌转化番茄，得到含有hEGF基因的番茄愈伤组织，再由愈伤组织培育出含hEGF基因的转基因番茄。

下面通过实施例进一步说明本发明的转基因植物的获得方法。本发明所提供的方法步骤如下：

一、从人脑cDNA文库中经PCR法获得hEGF基因，并在5’、3’端分别引入EcoRI和BamHI酶切位点，在5’、3’端分别引入起始码和终止码。

根据hEGF设计一对引物：

正向引物F是5’GCGAATTCATGAATAGTGACTCTGAATG3’，

反向引物R是5’CGGGATCCTTAGCGCAGTTCCCACCAC3’，PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒，58℃变性40秒，72℃延伸40秒，共30个循环，最后72℃延伸5分钟。PCR产物经EcoRI和BamHI双酶切后连接到载体puc18中，测序后确定组成中间载体hEGF/puc18，保存中间载体hEGF/puc18。

二、构建植物表达载体并转化根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)：

将中间载体hEGF/puc18和pPZP111G质粒双酶切，再连接组成植物表达载体hEGF/pPZP111G，通过冻融法转化到根癌农杆菌LBA4404中。三、转化目的植株1、转化芦荟(Aloeferox Mill好望角芦荟)

挑取含hEGF/pPZP111G的单菌落，放入10ml加100ml/L利福平，300ml/L链霉素，50ml/L硫酸卡那霉素的YEB液体培养基中，于28℃，150r/min恒温振荡培养过夜。当OD600为0.6时收集菌液，4000r/min离心10min，沉淀重悬于1/2 MSO液体培养基中。

将低温处理过的芦荟的子叶和下胚轴切成0.5cm长短，浸没于上述菌液中，5min后取出，吸去多余菌液，接种在附加1mg/L 2，4-D和0.2mg/L激动素(KT)的固体培养基MSD1上，于26℃，黑暗条件下共培养两天。

共培养后吸干外植体表面的菌液，接种到附加50ml/L硫酸卡那霉素和500ml/L羧苄青霉素的MSDI固体培养基上，2-3星期后转接到附加50--100ml/L硫酸卡那霉素和300ml/L羧苄青霉素的MSDI培养基上，诱导抗性愈伤组织的形成，将抗性愈伤组织培养在含100ml/L硫酸卡那霉素和100ml/L羧苄青霉素的MSDI固体培养基上，每2--3星期传代一次，经2-3次继代培养后，把抗性愈伤组织转入附加25ml/L硫酸卡那霉素和100ml/L羧苄青霉素的MSO固体培养基上诱导分化，30天后通过胚状体发育获得抗性植株，抗性植株在广口瓶中生长发育7-8片真叶后，移栽盆中，于温室种植。2、转化胡萝卜(Daucus carota)