[发明专利]脂肪酶基因序列及其在酵母中的应用

说明书

本发明涉及一种能在酵母(尤其是在毕赤巴斯德酵母)中表达的基因序列和可供其克隆的载体及可供其表达的酵母菌，以及酵母菌的筛选方法和从酵母基因工程菌中得到的基因工程脂肪酶。

脂肪酶(甘油酯水解酶，Lipase)是能够水解非水溶性酯类物质，如长链三甘油酯triglycerides(脂肪)，的酯酶。它在水脂介面上特异性地将脂肪水解为脂肪酸和甘油，并在非水介质中催化逆反应。脂肪酶水解发生部位为油脂的酯键，其催化反应如下：上述反应还可以进行到单酸甘油酯，直至水解成甘油。(Ghosh & Saxena，79(Pt 2)：119-571996；Sober & Palmeros，Crit Rev Microbiol，20(2)：95-105 1994)。脂肪酶在非水介质中还能催化酯化反应或改变酯键，在酯化反应和转酯反应中具有很高的专一性和相互选择性。脂肪酶广泛存在于动植物各种器官组织和微生物中。微生物脂肪酶种类很多，它们的生化特性和底物特异性与产生菌有关。对脂肪酶结构功能的研究主要集中于皱落假丝酵母Candida rugosa(又称柱状假丝酵母Candida cylindracea)。Candida rugosa脂肪酶是一种在脂肪酸的诱导下分泌产生的，由几种具有不同催化活性的异构酶组成的胞外脂肪酶。脂肪酶基因家族编码序列组成高度同源而底物作用区域结构各异的多种酶蛋白。Lip1基因所表达的酶蛋白是其中主要的一种。通过点突变合成的该基因在酿酒酵母和毕赤酵母中都得到了表达，在毕赤酵母中经过208小时发酵的表达量为150U/mL。(Lotti & Monticelli，Chem Phys Lipids，93(1-2)：143-8 1998 Jun；Grochulski & Bouthillier，Biochemistry，33(12)：3494-500 1994 Mar 29；Norin & Haeffner，Protein Sci，3(9)：1493-503 1994 Sep；Brocca & Schmidt-Dannert，Protein Sci，7(6)：1415-22 1998 Jun；Mileto & Brocca，Chem Phys Lipids，93(1-2)：47-55 1998 Jun；Longhi &Fusetti，Biochim Biophys Acta，1131(2)：227-32 1992 Jun 15)脂肪酶具有多种催化活性和宽广的底物作用特异性，在有机物中稳定性好，这些特性使它在有机工业系统中，如石油工业、食品加工、造纸业、新药开发、生物活化剂、洗涤剂、脱脂、增香、饲料添加剂、临床医学、皮革、皮毛、纺织和明胶工业中的去脂等，具有非常广泛的应用。目前，产自德氏根酶、柱状假丝酵母、曲霉、毛酶、粘质色杆菌等的脂肪酶制剂已供应市场。其中来自皱落假丝酵母Candida rugosa的脂肪酶(CRL)倍受市场青睐。(Lotti & Tramontano，Protein Eng，7(4)：531-51994 Apr；Benjamin & Pandey，Yeast，14(12)：1069-87 1998 Sep 15；Vaysse & Dubreucq，JBiotechnol，53(1)：41-6 1997 Feb 28；Gray & Narang，Enzyme Microb Technol，12(10)：800-71990 Oct；Holmquist，Chem Phys Lipids，93(1-2)：57-66 1998 Jun。)

本发明的第一个目的是提供一种能在酵母中有效表达的脂肪酶基因序列。

本发明的第二个目的是提供供上述基因序列克隆的载体。

本发明的第三个目的是提供能将脂肪酶分泌表达到酵母细胞外的上述载体之重组质粒。

本发明的第四个目的是提供具有上述基因序列的酵母菌。

本发明的第五个目的是提供上述酵母基因工程菌的筛选方法。