[发明专利]人胶质细胞衍生的神经营养因子及其衍生物及应用

说明书

本发明涉及人胶质细胞衍生的神经营养因子(human glial cellline-derived neurotrophic factor，简称GDNF)及其衍生物，以及基因重组技术生产该因子的方法。

本发明还涉及药物组合物，其中包括有效量的GDNF基因产物，该产物可用于治疗各种神经性疾病和错乱。

随着分子生物学的发展，利用DNA重组技术，可以构建表达蛋白质的一系列载体，从而使生物学家能够装配DNA序列以制得生产有用蛋白质的杂合分子。可利用各种反应，如用限制性酶切割，然后用连接酶连接如此得到的片段、组装化学合成的寡核苷酸，以及本领域内各实验室自己设计其他方法学(Maniatis，T.et al. Moleoular Cloning.ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1989).

为了得到高水平的表达，被装配的DNA元件必须存在某些必要的信息。例如，复制原点、抗生素选择标志、表达启动子、有用基因的转录激活因子以及本领域内专业人员已知的其他特性等。这些元件适当地结合即可产生一个质粒，如果有用基因被自然地插入到相关的转录和转译调节序列上，所得到的质粒便被称为表达质粒。该表达质粒或载体即可在宿主细胞内表达蛋白质，这样的宿主细胞可以是真核或原核生物来源的。经纯化后便可得到所需的蛋白质。

自然地控制许多基因如生长因子表达的元件(启动子)在其表达中并不是强有力的，而只有在合适的天然条件(常常是未知的)下才能被活化。为此目的，可使用有已知活性的启动子如乳头多瘤空泡病毒系列的病毒，或其他已知的启动基因序列。因此用于高水平表达的元件是各种来源(真核生物、细菌、病毒等)的DNA结合形式的杂合体，其中的末端部分可由不同基因部分相结合而成。

一种基因的转录活性取决于调节和编码序列之间的距离。

根据这些事实，使调节序列适当地工作的最好办法之一是将被引入的基因置于与天然基因相同的位置上。与所引入的基因结合后产生一种继后被切除的融合蛋白，以获得位于调节列最邻近位点的基因所使用的常规技术将取决于允许其克隆之适当限制性位点的存在。如果在邻近区域没有相匹配的位点，而只有其他位点，则可以通过合成含所需的限制性位点的寡核苷酸或接头来得到这些片段的结合体。

如果在邻近区域没有合适的限制性位点而不能使用接头，则可以利用Bal I31和SI缺失DNA的方法。但这样并不能得到精确的缺失，因此必须在各个时间对不同克隆进行序列分析，以检查哪一个是最适用的。

虽然用于分离具有新的生物学活性之蛋白质的方法通常包括从生物体液中纯化而分离蛋白质本身，但所获得的蛋白质总是不充足而不能用于继后对其结构、功能，特别是应用的研究。可利用DNA重组技术得到大量的蛋白质。

GDNF是目前正在研究的许多生长因子之一，它是一种以二硫键形式聚合的糖蛋白二聚体。体外实验表明：GDNF可以维持中脑多巴胺能神经元的存活，且具有较强的专一性(Lin-F，et al.，Science260(5111)：1130-1132；1993)，对运动神经元也有较强的保护作用(Henderson-CE，et al.，Science 267(5199)：777；1995)，有可能成为帕金森病和侧索硬化症的治疗药物。这些包括GDNF在治疗上可用于维持神经功能，并可用于防止和恢复在急、慢性病理状态下，包括影响周围、中枢和植物神经系统神经退化或免疫神经退化性质的各种病理状态下所造成的神经功能丧失和错乱。

编码GDNF的DNA序列如下：