[发明专利]家蝇抗菌肽基因及其克隆方法

说明书

本发明涉及一种家蝇抗菌肽基因及其克隆方法，属于分子生物学技术领域。

自从1981年伯曼(Boman)等人在昆虫中发现第一种抗菌肽以来，经过近20年的研究，现在已报道的昆虫抗菌肽有100多种。昆虫抗菌肽具有分子量小，热稳定性、水溶性好、抗菌谱广及材料来源丰富等优点。虽然从这些抗菌肽中显示出明显的结构多样性，但它们也有很多的共同特性：分子量较低，因此抗原性低；在生理pH下具正电荷，大多数具有双亲的α-螺旋或β-片层或同时具有两种结构。根据其序列结构和抗菌特性，已发现的昆虫抗菌肽可以归纳为三大类：即(1)即不含半胱氨酸的线形抗菌肽(2)具有半胱氨酸的环行抗菌肽(3)富含脯氨酸和/或甘氨酸的抗菌肽，参见陈留存，王金星，1999.昆虫抗菌肽研究现状。生物工程进展，19(5)：55-60。

目前已克隆的抗菌肽基因只有20多种。国内，南京大学、南京师范大学对家蚕的抗菌肽进行了较系统地研究。谢维等，1997，抗菌肽CMIV突变体基因在E.coli中融合表达的研究，中国科学C辑，27：278-283将化学合成的家蚕抗菌肽基因在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达成功，华南农业大学黄自然等对柞蚕抗菌肽也做了大量研究。在转基因研究方面，我国也有一系列的研究工作。贾士荣，屈贤铭等1996年将抗菌肽B基因导入水稻推广品种中百1号和京引37119号，首次获得抗白叶病和细菌性条纹病的转基因水稻，公开报道见王志兴，贾士荣，1996，抗菌肽分泌型载体的构建及转基因马铃薯中蛋白的胞外分泌，农业生物技术学报，4(3)：277-286。

抗生素类药物的应用开创了抗感染治疗的新纪元。当抗生素首次使用时，具抗性和不具抗性的病原体的比例小于1％，然而仅在抗生素应用几年之后耐药菌就出现，并随之广泛传播。每一种新抗菌药物的应用总是伴随耐药菌的出现，为了克服这一情况会有新的药物诞生和应用，然而同样地又可出现更顽固的耐药菌，甚至是多重耐药菌(MDR)，例如葡萄球菌(MRSA)、结核杆菌、肺炎球菌等对多种抗生素产生耐药性，致使目前许多临床应用的药物已无效。特别是近年来还出现一些新病原微生物，如嗜肺军团菌、空肠弯曲菌、幽门螺杆菌、卡氏肺孢子虫及HIV病毒等，这些病菌对感染性疾病治疗提出了严峻挑战，有些学者指出我们已面临“医疗灾难”的边沿。因此，发现和筛选具有新的作用机理的抗生素成为当前医药研究领域的迫切任务。

昆虫抗菌肽的作用机理与传统抗生素不同，它的靶位点主要是病原体细胞膜，因此不易产生抗性，并且抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，仅仅作用原核细胞和发生病变的真核细胞。改造过的抗菌肽不仅作用于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，而且也作用于真菌、原虫、某些病毒和肿瘤细胞，同时，还能加速免疫和伤口愈合过程，参见赵东红等，1999，昆虫抗菌肽的功能、作用机理与分子生物学研究最新进展，生物工程进展19(5)：14-18。特别是部分抗菌肽对一些临床耐药致病菌也有良好的抗菌作用，同时抗真菌肽的发现，对棘手的人类真菌病的治疗提供了新的思路。更为引人关注的是昆虫抗菌肽对癌细胞有杀伤作用，而对人体细胞无任何无不良影响，这是目前使用的肿瘤化疗药物所不具备的特性。在目前许多病原菌对现有抗生素逐步产生抗药性，而新的抗生素的发现极其困难的情况下，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。目前已经引起了人们的浓厚兴趣，国外已有一些公司投入大量人力物力进行肽类抗生素的研究。总之，昆虫抗菌肽的研究不仅在理论上具有重要意义，而且在实践上具有巨大的应用潜力，因此，它已成为当今生物医药研究的热点之一。家蝇以其生活在杂菌横生的环境中，接触并传播病菌，但它本身却不受其害，说明其体内存在着比其他昆虫更完善的或特有的免疫应答和分子保护机制，因此，研究家蝇抗菌肽可望获得具有特殊性能的、具更高活性的抗菌肽及其基因，用于生物医药产品开发和基因工程生产抗菌肽，并为抗病转基因作物研究提供目的基因。到目前为止尚无家蝇抗菌物质分离提取的报道，基因库中亦无家蝇抗菌肽基因。

常用的从昆虫中提取总RNA的方法有异硫氰酸胍法或RNA提取试剂盒法。异硫氰酸胍法，又称一步法，参见乔姆兹因斯基和萨奇的“用酸性异硫氰酸胍-酚氯仿一步法提取RNA”一文，载于《分析生物化学》162：156-169(Chomczynski，P.，N.Sacchi，1987.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phend-chloroformextraction.Analy Biochem，162：156-169)。