[发明专利]具有血管生成抑制作用的融合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种重组蛋白产物，具体讲是一种具有血管生成抑制作用的融合蛋白。

背景技术

正常的血管增生只限定于特定的情况，如外伤，胚胎形成，女性的生殖周期。血管的异常增殖可导致一系列的疾病，如肿瘤的生长和转移，糖尿病性视网膜增生，血管疾病如血管瘤，动脉粥样硬化，变态反应性疾病如关节炎等。

1971年Folkman教授首先提出了肿瘤的生长依赖血管的假设，多年来的研究结果已充分证明了这一理论。抑制血管生成，就可切断肿瘤的营养供应和血道转移途径，从而抑制肿瘤的生长和转移。1994年，Folkman实验室发现38KD的纤溶酶原片段angiostatin能够特异抑制血管内皮细胞的增殖及新生血管形成，并能显著抑制Lewis肺癌转移灶的生长(O′Reilly M S，Holmgren L，Shing Y，et al.Cell，1994；79：315-328)。随着研究的逐步深入，有关报导不断出现。如，WO96/35774公开了有关angiostatin及聚体的作用和使用方法；WO98/54217公开了angiostatin片段的使用；US 5,776,704公开了检测angiostatin的方法；US 5,801,012公开了angiostatin的产生方法；WO99/16889公开了angiostatin融合蛋白磁疗肿瘤的作用，其前导肽为白介素3(IL-3)等。

人的血浆纤维蛋白溶酶原包含了Kringle 1-5。Kringle位点是3个环状相连的二硫键结构，每个Kringle包含约80个氨基酸，各个Kringle有50％左右的序列相同。不同Kringle结构对内皮细胞增殖活性的抑制能力顺序为；K5＞K1＞K3＞K2＞K4(Cao et al.J.Biol.Chem，271：29461-29467，1996；Cao et al.J Biol Chem272：22924-22928，1997)。如，在WO99/00420中公开了K1-5体内调节血管生成的作用；US 5,801,146中公开了K5在抑制血管生成方面的作用；WO97/41824中公开了一种治疗血管生成疾病的哺乳动物K5片段和融合蛋白。

人体的免疫球蛋白Fc区域已成功与多种目标蛋白融合并表达成功，包括IL2，CD26，Tat，Rev，OSF-2，β1G-H3，IgE受体，PSMA和gp120(U.S.PatentNo.5,541,087and U.S.Patent No.5,726,044)。Fc区域包括CH1，CH2，CH3，CH4和Hinge区。常用类别为IgG的CH2，CH3及Hinge区，其余类别IgA，IgD，IgE和IgM也可使用。Fc区域能够增加融合蛋白的表达量，增强稳定性，延长其体内半衰期。

上述人体内源性的抗血管生成因子，一方面显示出很好的应用前景，体外显著抑制血管内皮细胞的增殖，体内显著抑制了原发性和转移瘤的生长，无毒副作用，反复使用体内不产生抗药性，与传统的放疗、化疗相比，具有很大的临床应用价值；但另一方面，由于其稳定性和用药量的问题，又在一定程度上限制了临床的广泛使用性。与一般细胞因子临床用量微克级相比，血管生成抑制因子临床有效用量一般都在毫克级，相差千倍。另外，由于是内源性的蛋白多肽片段，其活性也易于丢失。

发明内容

根据上述情况，本发明将提供一种可被应用于临床的高表达，高活性，高稳定性的具有血管生成抑制作用的不同结构形式的融合蛋白。

本发明所称的具有血管生成抑制作用的融合蛋白的核苷酸及相应的氨基酸序列为S-Fc-K5形式，其中：S为人粒细胞-巨噬细集落胞刺激因子(hGM-CSF)前导肽，Fc为人免疫球蛋白IgG Fcγ，K5为人血浆纤维蛋白溶酶原内的片段K5。该S-Fc-K5融合蛋白的核苷酸及相应的氨基酸序列为；

    GAA TTC ATG TGG CTG CAG AGC CTG CTG CTC TTG GGC ACT GTG GCC TGC AGC