[发明专利]狄乔治氏综合症的相关新基因及其蛋白

说明书

本发明属于分子生物学领域，涉及采用酵母双杂交系统和EST-PCR-RACE克隆技术寻找小儿先天性心脏病的相关基因以及在狄乔治氏综合症(DGS-DiGeorge syndrome)的诊断和治疗中的应用。

先天性心脏病(CHD-congenital heart disease)是所有人类生育缺陷中最常见的疾病。每年约有3万多新生儿患有CHD病，它是出生后第一年引起死亡的最主要原因。狄乔治氏综合症是先天性心脏病的典型代表之一。在新生儿其发病率是四千分之一[Pediatric Research 48:717-724,2000]。该综合症主要表现在耳朵畸形、腭裂、副甲状腺发育不足、胸腺-T细胞缺损、间断性主动脉弓、溢出径畸形以及胸腺发育不全。绝大多数(90％)狄乔治氏综合症患者具有染色体22q11.2区域的缺失，其长度达3百万碱基对(3-Mb)[Current protocols in molecular biology1996；J Endocrinology 1998,139:4870-4880；Am J Hum Genet,61:620-629,1997]。也有部分病人存在约2百万碱基对(2-Mb)的缺失，但缺失的部位与常见缺失部位仅有部分区域相同，如图1所示。另有报道称，染色体17p13位点的缺失也能引起类似DGS症状[Am.J.Med.Genet.31:1-4,1988]

虽然，狄乔治氏综合症已经研究了三十多年，并且证明染色体22q11.2和17p13缺失与该疾病有关，可是到目前为止没有任何单一基因被证明能引起该综合症。某些基因，例如HIRA和UFDIL存在于22q11.2部位，并且是在DGS患者受到影响的组织中得到表达[Circ Res 84:127-135,1999,Science 283:1158-1161]。然而，鼠单缺失HIRA或UFDIL显然属于正常情况[Nature 401:379-383,1999]。由于大部分病人被检测到的缺失达几百万碱基对，越来越多的证据表明，这一综合症可能是由多基因联合控制的[Pediatric Research 48:717-724,2000]。

本发明阐明了三个与DGS相关的基因FKSG1、FKSG3和FKSG4的克隆、表达产物的鉴定和制备。其目的是提供三种新的多核苷酸序列，提供三种新的蛋白以及利用重组技术生产所述新蛋白的方法，同时还提供这些新基因和蛋白在诊断和治疗狄乔治氏综合症中的应用。

本发明的内容与技术方案如下：1 DGS相关基因FKSG1的克隆

为了鉴别存在于DGS病人经常缺失的22q11.2区域内的新基因，本发明采用了一种特殊的cDNA克隆方法[Life Sciences63(17):1555-1562,1998]。该方法综合采用了cDNA选择、EST(expressed sequence tag)定位、基因组DNA序列分析、PCR反应以及克隆末端延展(RACE-Rapid amplification of cDNA ends)等技术。本发明根据所涉及的几个要素的组合从NCBI的EST数据库进行检索，结果表明存在217个阳性克隆片段，用来自每一个阳性克隆的cDNA片段与NCBI的GenBank中所报道的已知基因进行比较，进一步分析比较结果，发现有一个EST克隆(AA312178)含有328个碱基对，该序列与任何已知的序列均不相同，但存在于基因组序列片段(AC000089)。如图1所示，AC000089存在于DGS病人常缺失区域。AA312178在AC000089片段中存在于3个不同的部位。AA312178中的头96个碱基与AC000089片段中37192-37094部位的碱基完全相同；AC312178中的97-259碱基与AC000089片段中28946-28783部位的碱基一样；而AA312178中的最后部位260-328与AC000089中23255-23228区域的碱基相吻合。这些结果表明，EST AA312178克隆含有1个未知新基因的部分片段，用AA312178的核苷酸序列进一步查询EST数据库发现，AI870670克隆与AA312178部分相重叠。

继而合成了两个引物：引物A：5’-TCGGTCTCTGGACGCTGCGCGGCG-3’来自AA312178(SEQ ID

   NO.1)    引物B：5’-CGTCTTGGAGGGCATCTCCAGAAT-3’来自AI870670(SEQ ID