[发明专利]一种用于来自叶外植体的茶树植物的微体繁殖的方法

说明书

本发明涉及一种采用从叶子中切割的外植体、用于茶树植物(茶(Camelia Sinensis))微体繁殖的有效方法。

茶是一种受欢迎的具有抗癌特性的含咖啡因饮料(Jankun等，为什么饮茶可以预防癌症，《自然》5：561；1997)。虽然山茶属有许多种，但仅C.sinensis(L.)O.Kuntze或茶和其不同栽培品种在商业上是很重要的(Braua D.N.编辑，《茶叶栽培中的科学和实践》，加尔各答茶研究协会；53-68；1989)。

茶叶栽培不仅是重要的职业提供源，而且也是世界所有茶叶生长地区挣取外汇的主要途径(Wilson，R.C.编辑的《咖啡、可可和茶》中的Wilson，K.C.“植物学和植物改良”，CABI出版，Wallingford，UK：167-173；1999)。但是，茶叶的总产量不足以满足本国和世界市场的需要(Kabra，G.D.《1999年茶时期的茶叶统计资料》，VolVIII，No.3 9-11，99，30-31；1999)。由于不同的生命性的(真菌、害虫和病毒)和非生命的(冰冻、冰雹、寒冷、干旱、营养不良等)应力(Wilson，R.C.编辑的《咖啡、可可和茶》中的Wilson，K.C.“植物学和植物改良”，CABI出版，Wallingford，UK：167-173；1999)使茶叶的产率和质量进一步降低。

实际属于木本树种的茶树具有伴随着高度自身不相容性和近亲繁殖衰退的长的生活周期(Braua D.N.编辑，《茶叶栽培中的科学和实践》中的Braua D.N.“茶树贸易”，加尔各答茶研究协会；53-68；1989)，这通常限制了通过常规的培育方法生产高产率且优等和抗应力茶树。因此，生物技术方法的应用是一种有效且供选择的方法。但是，一种有效率且能繁殖的再生方法对于任何生物技术应用是最重要的预先必需。

茶叶中的最严重问题是水疱枯萎病，因为它侵害用于制茶的叶子和幼芽，结果产率下降了50％。因此，抑制水疱枯萎病对于弥补这些损失是非常急需的。已确定了一些具有高产率和高质量但易患水疱枯萎病的克隆，因此需要通过诸如叶外植体的同源组织的生物技术改良，因为诸如子叶外植体的异质组织会导致基因分离和所需的高产率和高质量的特性的丧失。因此，现存的方法在于诸如子叶外植体的异质组织不具有上述有关用途，急需研制采用同源组织的微体繁殖的方法。叶外植体的再生是最佳优选，因为：

(i)叶外植体是同源的；

(ii)叶子含有极大量复制数的叶绿体DNA，因此如果基因操作过程如转基因或体细胞杂交的研制中使用叶子，则叶子表达可以扩增数倍；

(iii)叶子为任何基因操作技术提供了大量表面；

(iv)叶子是市售的成品茶的主要商业来源；

(v)叶子提供了丰富的原料供应；

(vi)采用叶子作为外植体不会防碍植物一般的优良特性和生长。

倘若在再生过程中没有出现体细胞克隆变异，那么通过体细胞杂交或通过转基因技术的生物技术作物改良通常需要经愈伤组织相的再生。由于茶树寿命长，与快速生长的草本植物相比，愈伤组织相中的染色体变异的可能性要低。因此，已经研究了用于使用经愈伤组织相的叶外植体的茶树植物的微体繁殖的有效的间接方法。

因此如果使用叶外植体或如果植物为50年或更长的非常老的树，木本植物的再生能力很差。

为了产生经体细胞胚胎发生的植物或经愈伤组织相的未定形幼芽形成，但两者之中任一的转化频率低(4-6％)或生根很少，已将叶外植体用于山茶属的其它观赏植物种中，例如C.japonica和C.reticulata(Sanjose和Vieitez，A.M.成熟山茶属(Camellia)reticulata的体外叶子的未定形幼芽再生，《园艺科学杂志》67：677-683；1992；Sanjose，M.C.和Vieitz，A.M.“通过胚胎发生和柄发生来源于叶外植体培养物的山茶属小植株的再生”，《园艺科学》，54：303-315；1993；Pedroso，M.C.和Pais，M.S.C.japonica L.“叶中的直接胚胎形成”，《植物细胞再配(Rep.)》12：639-643；1993)。而且，这些均是观赏植物种。但是，没有关于通过C.sinensis即商用的山茶属或茶树中的愈伤组织、来自未定形幼芽形成的叶外植体的植物再生的方法的报道。