[发明专利]一种人胰岛素重组基因、制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种人胰岛素重组基因、制备方法和作为治疗糖尿病药物的应用，属于生物制药技术领域。

自1980年人胰岛素基因序列解明以后，有许多关于人胰岛素基因作为治疗糖尿病药物研究的报道，但现在所称的人胰岛素基因，实际为人胰岛素原基因，直接表达产物是活性较低的胰岛素原，由B链、C肽、A链86个氨基酸的单链多肽组成，而胰岛素原只有在胰岛β细胞内，被羧肽酶切掉C肽部分，才能成为成熟的活性很高的胰岛素及C肽，1992年由日本的Masahiro与Yanagita等人，对大鼠I型胰岛素基因进行了定点突变，以使胰岛素原的C肽部分可以被动物体内，普通细胞内存在的一种蛋白水解酶Furin或PACE切掉，成为成熟的胰岛素及C肽。此后亦有很多关于人胰岛素基因定点突变的研究报道，但他们所进行的定点突变多是在靠近C肽部分的B链或A链氨基酸上完成的。

本发明的目的在于提供一种在C肽氨基酸上完成的定点突变人胰岛素基因，并添加第一内含子重组改建，这样第一可避免改变胰岛素B、A链的氨基酸成分，保证与正常胰岛素的氨基酸成分一样，提高效用降低由不同于正常胰岛素氨基酸组成成分的不良作用。第二可以提高表达量，增加表达产物的调控作用，这对利用体细胞基因制备治疗糖尿病药物有重要的应用前景。本发明的技术方案是这样实现的：这种人胰岛素重组基因序列(见附图1)，序列长度1789个碱基，重组序列特征为第669-674碱基是密码子AAG、密码子CGC；第1536-1538碱基是密码子GGA；第1542-1544碱基是密码子CGG；第305-483个碱基是扩增的第一内含子。

所述的人胰岛素重组基因制备方法，包括：a.制备突变载体和突变模板：用限制性内切酶NcoI和SphI将人胰岛素基因组基因DNA片段取下，克隆进M13mp18噬菌体内，作为突变用载体，该噬菌体内含尿嘧啶的单链DNA作为突变用模板；b.定点突变：利用定点突变引物1：5′-CTGCAGGTCCTCGCGCTTCCGGCGGGTC-3＇、定点突变引物2：5＇-CACGCTTCTGCCGGGATCCCTC-3＇与T4DNA聚合酶进行寡核苷酸介导的定点突变，并克隆该噬菌体及其提取DNA；突变位点：第669-674、1536-1538、1542-1544个碱基；c.构建成表达载体：将突变后的人胰岛素基因组基因DNA1.3kb片段，经DNA限制性内切酶ApaI切下回收，克隆进质粒PRC/CMV的多克隆位点上，构建成定点突变人胰岛素基因组基因质粒(pCMV/mhINS质粒)；d.补平酶切后质粒断端：定点突变人胰岛素基因组基因质粒(pCMV/mhINS质粒)经DNA限制性内切酶XbaI、BamHI、NcoI、SacI、ApaI酶切后，70℃加热10分钟灭活DNA限制性内切酶，并补加核苷三磷酸和大片段酶，以补平酶切后定点突变人胰岛素基因组基因质粒断端；e.扩增连接：利用第一内含子特异性引物1：5′-GTTCTAGACAGGCTGCATCAG-3＇、第一内含子特异性引物2：5＇-TACCATGGCAGAAGGACAGTG-3＇从人胰岛素基因组基因DNA中将第一内含子扩增0.23kb的DNA片段；经DNA连接酶(Ligase)与pCMV/mhINS质粒连接构建成含第一内含子的定点突变人胰岛素基因组基因重组质粒(pCMV/ImhINS)，第一内含子位点：第305-483个碱基；f.重组质粒pCMV/ImhINS的克隆扩增：重组质粒DNA转化入大肠杆菌DH5a后，进行细菌培养扩增；g.重组Pcmv/ImhINS质粒DNA的提取：在大肠杆菌中复制的重组质粒经分离抽提、沉淀冷冻干燥制成人胰岛素重组基因。3、根据权利要求2所述的一种人胰岛素重组基因方法，其特征在于所述的构建突变用载体的方法a.包括：混合人胰岛素基因组DNA 1μL(0.1-0.4μg)、酶切缓冲液2μL，限制性内切酶NcoI和SphI 1U/μgDNA、加水至20μL，37℃反应1小时；0.4％琼脂糖凝胶电泳回收1.3kb酶切产物；将M13mp18用限制性内切酶SmaI和SphI双酶切，用连接酶将1.3kb酶切产物与M13mp18连接，构建成突变用载体M13mp18/INS；提取该噬菌体的单链含尿嘧啶的DNA，作为定点突变用“U”模板。

所述的一种人胰岛素重组基因制备方法中所述基因定点突变方法b包括：(1)、突变引物的5’端引物OH磷酸化；(2)、突变引物与单链DNA“U”模板杂交和延伸反应；(3)、对JM109F＇大肠杆菌的转染和突变体的筛选。