[发明专利]猪胰岛细胞DNA的制备方法及作为治疗糖尿病药物的应用

说明书

本发明涉及猪胰岛细胞DNA的制备方法及作为治疗糖尿病药物的应用，属于生物制药技术领域。

应用胰岛细胞DNA作为治疗糖尿病药物的研究方面，已有关于胎儿胰腺全DNA介导的胰岛素基因转染及表达的研究，并取得初步成果的报道。另有美国、加拿大利用人体细胞DNA治疗心血管疾患已进入临床实验阶段的报道。胎儿胰腺全DNA介导的胰岛素基因转染及表达的研究，主要问题在于供体来源问题，我国目前的人口政策和医疗水平的不断提高中期引产和终止妊娠例数将愈来愈少，供体来源匮乏会非常明显。在临床上利用猪胰岛细胞移植治疗糖尿病亦有相关报道，存在的问题是异种免疫排斥要靠大量药物维持。

本发明的目的是利用猪胰岛细胞，特别是β细胞(主要合成与分泌胰岛素细胞)提取具有活性的胰岛素功能基因组基因的方法及制备治疗糖尿病的药物，以解决胰岛细胞DNA供体来源和降低异种免疫排斥问题。

本发明的技术方案是这样实现的：猪胰岛细胞DNA的制备方法是：a.取猪胰活体组织，液氮冷冻研磨；b.加入细胞裂解液和0.1mg/mL蛋白酶K于37℃振荡15-18小时；C.加入苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1于4℃离心抽提20分钟，取上清液；d.加入等体积氯仿于4℃离心抽提20分钟，取上清液，重复2次；e.加入1/2体积7.5M乙酸铵、2倍体积无水乙醇，取悬浮DNA；f. 70％乙醇洗涤2次g.冷冻干燥h. -20℃冷冻保存备用。

所述的猪胰岛细胞DNA的制备方法，其特征在于所述的细胞裂解液的组成是100mmol/L NaCl，10mmol/L三羟甲基胺基甲烷(Tris)，25mmol/L EDTA，0.5％十二烷基磺酸钠(SDS)。

所述的猪胰岛细胞DNA作为治疗糖尿病药物的应用，其特征是猪胰岛细胞DNA可以作为临床上治疗糖尿病的药物原料。

所述的猪胰岛细胞DNA作为治疗糖尿病药物的应用，其特征是猪胰岛细胞DNA可以制成临床上治疗糖尿病的冻干粉末制剂形式、静脉及肌肉注射溶液制剂形式、脂质体制剂形式、微胶囊制剂形式。

本发明利用猪胰岛细胞，特别是β细胞(主要合成与分泌胰岛素细胞)里具有活性的胰岛素功能基因组基因，经体内肝细胞及肌组织的直接转染实验研究，比较胎儿胰腺全DNA它可以很好地解决供体来源，而对比猪胰岛细胞移植可降低异种免疫排斥问题，并较之单纯胰岛素基因，可能更有效地起到调控作用控制血糖变化。

下面结合流程图详细说明本发明的实施例：

图1为猪胰岛细胞DNA的提取及制备工艺流程图

制备方法是：取活体猪胰体及胰尾部组织10g(即：β细胞主要存在部位)，液氮迅速冷冻研磨，加入细胞裂解液12ml(100mmol/L NaCl，10mmol/L三羟甲基胺基甲烷(Tris)，25mmol/L EDTA，0.5％十二烷基磺酸钠(SDS)，pH8.0，购自北京化学试剂公司)，0.1mg/mL蛋白酶K，购自Sigma公司)于37℃恒温、轻微振荡15-18小时，加入等体积饱和重蒸苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1抽提(购自北京化学试剂公司)，温度控制在4℃、离心力20000g、离心20分钟，取上清；再进行等体积氯仿抽提，温度控制在4℃，离心力20000g，离心20分钟，取上清，重复以上抽提步骤一次，取上清；加1/2体积7.5mol/L乙酸铵，2倍体积无水乙醇(购自北京化学试剂公司)，取悬浮DNA，用70％乙醇洗涤2次；冷冻干燥，-20℃冷冻保存备用。

上述工艺制备的冻干猪DNA粉末可以作为制备治疗糖尿病药物的原料，如用于合成胰岛素；还可以作为制备临床上应用的治疗糖尿病的制剂，如粉针剂、或溶于生理盐水中制备注射用制剂，还可以与其它药物结合制备脂质体、微胶囊等临床上适用于治疗糖尿病的药物制剂形式。