[发明专利]人源抗甲肝病毒中和性基因工程全抗体

说明书

本发明涉及预防和治疗用人源基因工程单克隆抗体的制备及应用，尤其是特异性针对甲肝病毒VP1蛋白的中和性基因工程单克隆抗体。

自1975年B淋巴细胞杂交瘤细胞融合技术问世以来，单克隆抗体作为一类用于基础研究，实验室诊断，临床治疗和预防的新型产物，其运用价值和开发前景已获得普遍的肯定。分子生物学和分子免疫学的研究发展导致了基因工程抗体的产生和发展。通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源及人源抗体，使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景。80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，使当今世界人源或基因工程抗体的开发研究取得很大进展并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段(1)。目前美国FDA批准上市或待批的生物制品中，各种形式的单克隆抗体和基因工程抗体占到一定比例，目前以批准上市的67种生物制品中，治疗和预防用单克隆抗体和基因工程抗体共有9种。正在待批中等抗体有35种(2)。其中已批准上市并且产生巨大经济和社会效益的四种人源化基因工程抗体中，其中有一种即为抗病毒基因工程抗体，其商品名为“SynagisTM″，为人源化抗呼吸道合病毒(RSV)基因工程抗体(3)，而来源于噬菌体抗体库筛选的人源抗RSV病毒基因工程抗体已被批准进入Ⅱ期临床，另一种抗病毒抗体抗乙型肝炎表面抗原抗体也在审批之中。

至今为止，大多数病毒性疾病无特异性治疗药物，用于临床治疗和预防某些病毒性疾病的生物制品仍然以血制品为主，如多年来临床上使用的血源性丙种球蛋白，用于甲肝或乙肝病毒引起的病毒性肝炎以及麻疹等，这些血制品中不仅非特异性杂蛋白多，特异性抗体含量很低，而且最大的问题是血源制品潜在的未能检出的病原污染问题，从长远利益考虑应当摒弃。因此以人源基因工程产品替代血制品已成为国内外研究的一大方向，并正在逐步走向成功。用纯鼠源单克隆抗体预防和治疗病毒性疾病在国际上尚无任何批准的先例，国内有提出申请用于抗脑炎和出血热的临床治疗，鼠源抗体人用最大的不利之处为异源蛋白，在人体内易引起遗传免疫排斥而使抗体失效并引起免疫性疾病。因此，特异性抗病毒人源中和性抗体是病毒性疾病预防和治疗的最有前景的生物制品之一。人源抗病毒基因工程抗体的研究除已成功的抗RSV抗体外，通过噬菌体表面呈现系统，基因工程抗体库技术和分子生物学手段的联合运用，这一领域的研究已取得重大进展目前已研制成功的人源抗病毒抗体有抗以下病毒的抗体：呼吸道合胞病毒(3)，爱滋病毒(HIV)(4)，乙肝病毒(5)，丙肝病毒(6)，单纯疱疹病毒(HSV)(7)，汉坦病毒(8),B19病毒(9),CMV病毒(10),VZV(10)等以及尚未发表的本所已研制成功的抗甲型肝炎病毒，狂犬病毒抗体等。抗甲肝抗体制剂研制成功，将为国内外首创，有可能获一类新药证书。

本发明的目的是将已获得的中和性抗甲肝病毒Fab抗体基因与人源IgG恒定区基因重组，通过重组杆状病毒-昆虫细胞表达系统，在昆虫细胞中生产针对甲肝病毒的具有明显中和功能的分泌型完全人源IgG抗体，为将来可能的临床抗病毒预防和治疗提供可行性的特异性抗体药物，并有望取代目前市场上的血源性并种球蛋白。本发明陈述的人源抗甲肝病毒中和性基因工程全抗体包括：

1．为来源于噬菌体抗体库筛选的并与人源IgGFc基因重组表达后的IgG1λ全抗体，它由两条重链和两条λ轻链组成。分子量为150kd左右。

2．是通过重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中获得高效表达的特异性结合和识别甲肝病毒VP1蛋白的高亲和力中和性人源完全抗体。

3．其结合甲肝病毒VP1蛋白和中和病毒感染的功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域(Complementarity-Dertemining Regions,CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域。

4．特异性的轻链和重链基因来源于对人源抗甲肝病毒抗体基因库的特异性富积筛选表达，其相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列，已在专利申请号为CN00105698.0的专利申请中陈述。

5．该抗体为重组基因工程抗体，其基因组成特征：由全长IgG1重链基因和全长lambda链轻链组成，其轻重链先导序列和重链Fc基因来源于载体pAc-L-Fc，已在专利申请号为00105698.0的专利申请中陈述。在轻链基因先导序列和VL基因之间含有SacⅠ酶切点；在重链基因先导序列和VH基因之间含有XhoⅠ酶切点；在重链Fd基因和Fc基因之间含有SpeⅠ酶切点。