[发明专利]性染色体短串联重复序列四位点复合扩增试剂盒及扩增法

说明书

本发明涉及分子生物学、法医学、遗传学领域聚合酶链反应复合扩增技术。

短串联重复序列(short tandem repeat，STR)是人类基因组中一类重复序列，对于某个基因座(又称位点)上的STR来说，其重复单位(又称核心序列)往往是相同的，在人群中不同个体之间因为核心序列的重复次数不同，这一片段的DNA长度也不同。用扩增技术可将同一个基因座上的、不同个体之间存在的各种不同的STR片段(等位基因)扩增并显示出来。STR序列广泛分布于染色体的DNA序列中。大量的遗传学群体调查证明，在常染色体中的STR片段(等位基因)是按照孟德尔遗传规律一代一代传下去的。

X、Y染色体是人体的性染色体。X染色体通过母亲传给子女，而Y染色体则通过父亲传给儿子。在性染色体中同样存在许多STR位点，而且这些位点是以单倍型的方式传递的。因此，可以通过分别检测X或Y染色体上的STR位点的等位基因组成的单倍型来区分个体，或确定有争议的母子、母女或父子之间是否存在亲生关系。不过，由于单个STR位点所含有的等位基因数量有限，因此分辨能力不高。

为了提高检测STR位点的分辨能力，以往的做法是增加检测的STR位点。但每一次实验只能增加一个位点。这样，大大增加了工作量，耗时费力。而且在检测实践中，送到实验室的检材的量往往很少，不足以做多次实验用。如何解决这个问题十分重要。

本发明的目的是提供一种新的试剂盒，这种试剂盒可同时对X或Y性染色体的四个位点的STR等位基因分型，并使分辨率明显提高。

本发明的第二个目的是提供一种新的扩增方法，以提高特异性。

本发明的试剂盒主成份为

X引物对HPRT、DXS6799、DXS6804和DXS7132，或/和Y引物对DYS389、DYS390、DYS19和DYS388。

各引物对的浓度为0.1～0.4Aμmol/L，其中A＝1～50。

本发明的试剂盒辅助成份为

反应缓冲液成份：内含KCl 50Ammol/L，Tris-HCl(pH8.4)10Ammol/L，MgCl₂ 1.5Ammol/L，明胶0.05Ag/L，其中A＝1～50。

dNTP：0.15Ammol/L，其中A＝1～50。

本发明的试剂盒还可包括

Taq DNA聚合酶0.5~1A U，其中A＝1～50。

上述A值可以大于50，即可以将各种试剂配制成更浓些，或至饱和、或是固体。使用时用水稀释。

以上试剂是同时对X或Y性染色体的四个位点的STR等位基因分型进行PCR扩增反应时使用的成分。将它们放在一起，做成试剂盒，以方便使用。应用本发明试剂盒进行PCR扩增反应时，将其配成PCR反应液，加入微量被检模板DNA，按下面介绍的扩增方法进行热循环。

本发明的试剂盒可不含Taq DNA聚合酶，而在反应时与被检模板同时加入。

本发明的扩增反应方法包括如下步骤：

1、将上述引物、反应缓冲液、dNTP、TaqDNA聚合酶和被检模板DNA混合，必要时加水稀释；

2、将混合反应液进行热循环：95℃ 5min；然后94～95℃ 45S，50-60℃ 45S，70-72℃ 1min，30个循环；最后72℃ 5min。

下面给出实施例。一、试剂盒：包括

X引物对HPRT、DXS6799、DXS6804和DXS7132，或/和，Y引物对DYS389、DYS390、DYS19和DYS388，各引物对的浓度为1μmol/L；

反应缓冲液成份：内含KCl 500mmol/L，Tris-HCl(pH8.4)100mmol/L，MgCl₂ 15mmol/L，明胶0.5g/L；

dNTP：1.5mmol/L；

Taq DNA聚合酶5U。二、PCR反应内容物配制

用上述试剂盒(A＝10)试剂配反应操作液，总体积50μl。含KCl 50mmol/L，Tris-HCl(pH8.3)10mmol/L，MgCl₂ 1.5mmol/L，明胶0.05~0.15g/L，dNTP 0.15mmol/L，X或Y引物对各0.1~0.4μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5~1U，加入被检模板DNA 0.5~20ng。三、热循环

预变性95℃ 5min；然后94℃ 45s，50～60℃ 45s，72℃ 1min，30个循环；再72℃ 5min。4℃保存。四、常规电泳分析