[发明专利]用酪氨酸酶反义脱氧寡核苷酸防止皮肤的色素沉着

说明书

黑色素细胞来自胚胎的神经嵴，在胚胎早期移至皮肤。这种细胞合成棕褐色、红色和黄色的色素颗粒，使人类有不同肤色。黑色素细胞含有一种特殊的细胞器官即黑色素小体，黑色素即在这些细胞器官中合成。黑色素小体内有一种特殊的酶即酪氨酸酶，将酪氨酸氧化成多巴，继而氧化成多巴醌，最后生成黑色素。一旦黑色素小体完全黑色素化，生成的黑色素颗粒通过黑色素细胞的树枝突被输送到邻近的表皮细胞中产生色素。黑色素是一种大聚合体，它具有吸收波长从200-2400mm大范围光线的独特能力。已经证明不同人种的皮肤中黑色素细胞的数量是一致的，其主要差异是黑色素合成的多少而造成皮肤颜色的差异。因此，黑色素细胞中产生黑色素的关键酶即酪氨酸酶的活性对于调节皮肤色素的沉着起着至关重要的作用。

皮肤的色素沉着主要是指皮肤的黑色素产生过多所致。在日常的皮肤保护方面主要针对因紫外照射或日晒引起的色素沉着，以及生理因素等引起的色素沉着，如雀斑和黄褐斑等。这都与黑色素细胞中的酪氨酸酶的活性增强有关。目前应用在皮肤化妆品中防止色素沉着的物质主要是通过筛选可抑制酪氨酸酶的方法而获得，有天然提取物和化学合成物。

随着生物技术的发展，人酪氨酸酶的基因被发现、克隆和深入研究。人酪氨酸酶基因编码区由1590bp组成，编码含536个氨基酸残基的蛋白酶，位于116号染色体，含有5个外显子，具有5′端的基因表达调控区。近年在酪氨酸酶基因研究中，对其调控区的基因分析取得了非常大的进展。已知它具有独特的增强子和启动子等调控单元，这些区域对酪氨酸酶基因的表达起到开关的作用。无论是内源性的还是外源性的物质，均通过作用于其基因调控区来影响酪氨酶基因的表达，从而抑制或增强酪氨酸酶的活性，起到调节黑色素产生多少的作用。

紫外线照射可引起皮肤色素沉着。一般日晒3-4天，皮肤形成新的黑色素，从而使皮肤逐渐变黑。

面部黄褐斑是黑色素细胞所产生的黑色素比正常时增多，为对内分泌激素的一种反应，并与紫外线射有关。其形成与酪氨酸酶活性增强密切相关。

雀斑是见于暴光区的残红色棕色斑，为黑色素形成增多所致，而黑色素细胞数目正常，

与酪氨酸酶活性增强相关。

反义核酸其实是能与一段特异基因序列互补结合的寡核苷酸片段。这种寡核苷酸片段可以是DNA或RNA，除了人工方法合成外，也可通过重组技术生物合成。反义寡核苷酸片段一般由十至几十个碱基组成，通过全自动人工合成而得。为了有利于进入细胞和防止核酸酶水解，多进行修饰处理，最常见的是碱基磷酸根上的羟基被硫基或甲基取代。应用反义核酸技术在研究基因表达调控方面，在治疗感染性疾病和肿瘤等方面取得了重要进展。反义核酸药物已应用于临床，反义核酸的农副产品已供人们食用。

近年有文献报道应用针对酪氨酸酶反义核酸来研究酪氨酸酶基因的表达调控和对酪氨酸酶活性的影响，证明能有效抑制酪氨酸酶在黑色素细胞中的产生，使黑色素形成减少。

本专利在于提供一种在防止皮肤沉着方面，用反义核酸技术来抑制酪氨酸酶的产生，从而使皮肤细胞中黑色素减少。这种由人工合成针对酪氨酸酶基因5′端编码区的15-20碱基的反义脱氧寡核苷酸片段，经硫代化修饰后，具有较好的稳定性和细胞穿透性。在加入皮肤日常的化妆品基质中，能起到抑制因多种因素引起的皮肤黑色素细胞中酪氨酸酶基因表达，从而减少黑色素的产生，达到防止皮肤色素沉着的作用。

             实例一  酪氨酸酶反义脱氧寡核苷酸的制备

人源性的酪氨酸酶由527个氨基酸组成，其编码区由159bp组成，选择起始密码子ATG后的18个碱基序列作为其反义核酸特异封闭的序列是5′-CTC CTG GCT GTT TTG TAC-3′。用DNA合成仪合成经硫代磷酸型修饰的反义脱氧寡核苷酸片段，序列为5′-GTA CAAAAC AGC CAG GAG-3′，命名为S-AON。其寡核苷酸片段由18个碱基组成，经硫代化修饰，与酪氨酸酶起始密码子后18个碱基特异互补。经DNA合成仪合成的酪氨酸酶反义脱氧寡核苷酸S-AON，经反相纯化后高效液相色谱(HPLC)纯度大于90％，经尿素变性聚丙烯酰胺电泳证实为18碱基的单片段。

  实例二  酪氨酸酶反义脱氧寡核苷酸(S-AON)抑制黑色素产生的作用