[发明专利]柯萨奇病毒B分型免疫球蛋白抗体G酶免盒及制备方法

权利要求书

1.一种柯萨奇病毒B1-6分型抗体IgG试剂盒，其特征在于该试剂盒用CoxB病毒B1-6分型抗原包被，兔抗人IgG联接辣根过氧化物酶为检测抗体，检测血清中的CoxB病毒B1-6分型抗体IgG，并且试剂盒由下列组成：预包被反应条   48孔/96孔(盒) 酶结合物工作液； 1瓶(10ml)样品稀释液     1瓶(6ml)      阳性对照         1支(200μl)阴性对照       1支(200μl)   20倍浓洗涤液     1瓶(13ml)显色剂A        1瓶(3ml)      显色剂B          1瓶(3ml)终止液         1瓶(3ml)

2.一种如权利要求1所述的一种柯萨奇病毒B1-6分型抗体IgG试剂盒的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：一、原材料及其规格

CoxB病毒B1-6分型IgG抗原的包被；酶标板：华东理工大学ELISA测定CV(％)＜10％阳性对照：诊断心肌炎患者血清，用本试剂盒测定A值＞0.8，放置-20

      ℃备用；阴性对照：选正常人血清，用本试剂盒测定A值＜0.09，放置-20℃备

      用；酶标抗体：兔抗人IgG-HRP，(辣根过氧化物酶，RZ＞3.0 Sigma进口)酶标记兔抗人IgG，双扩散1∶64；小牛血清：杭州四季清厂生产；其它试剂：

Na₂CO₃                A.R

NaHCO₃                 A.R

小牛血清                 杭州四季清厂生产

Na₂HPO₄·12H₂O       A.R

NaH₂PO₄·2H₂O        A.R

NaCL                    A.R

Tweel-20                化学纯

甘油                    化学纯

H₂O₂                  A.R

柠檬酸.H₂O              A.R

TMB                      熔点：168℃

EDTA                     A.R

H₂SO₄                 A.R

Tris                    A.R蒸馏水必需符合《中国药典》(1990)之规定细胞及动物要求：(1)Hela细胞(ATCC    CCL-2)(2)新西兰大白兔     2公斤左右二、包被抗原(CoxB病毒1-6分型抗原)的制备；(一)CoxB病毒1-6型的制备(1)CoxB病毒1-6型毒种来源：昆明生物所(2)Hela细胞来源：中科院细胞所(3)细胞传代：①培养剂配制：

PRMI1640基础培养过滤除菌，200ml基础培养剂中含：牛血清10％

青霉素4万单位

链霉素4万单位

6％NaHCO3 4ml

3％谷氨酰胺 6ml②胰酶(DT)配制：

用无Ca、Mg离子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化细胞；③细胞传代：

将成片的细胞倾去培养液，加入DT进行细胞消化，观察细胞已呈疏松网状，既倒去DT，加入营养液后，分瓶培养培养3-5天；(4)CoxB1-6型病毒的感染、培养、收毒和鉴定：①将形态完整、成片的单层细胞倾去培养液后，用不含牛血清的洗  液洗一次；②细胞感染病毒后，在37℃吸附1小时；③补充培养液，在37℃培养；④逐日观察细胞：至所有细胞产生细胞病变后，用无菌方法收获病  毒；⑤微量平底板进行病毒浓度的滴定和病毒鉴定；病毒滴定：

用10倍的倍比稀释的方法进行病毒的稀释，病毒加入微量板中，每孔加50μl病毒，每个稀释度加4孔，然后加入细胞50μl，设细胞对照，按Reed-Muench方法计算病毒的TCID50；病毒的鉴定：

应用免疫电镜法和应用中和试验方法(微量滴定法)

1-6型病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔内，25μl/孔，抗血清作1∶4-1∶1024连续4倍稀释，25μl/孔，每个稀释度4孔，将板加盖，37℃中培育2小时；然后每孔内加Hela细胞50μl，同时设病毒阴性、阳性对照，逐日观察细胞病变；是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出现CPE；(5)抗原的制备、浓缩和纯化：①病毒灭活；②去除病毒碎片：用冷冻离心的方法去除细胞碎片；③初步浓缩、提纯：用PEG方法进行提纯；④1-6型病毒的进一步纯化：用葡聚糖过柱、洗脱的方法，然后在  A280的分光光度计进行1-6型病毒蛋白含量的测定；三、兔抗人IgG(r)的制备(1)人IgG(r)链的制备(2)30ml人脐带混合血清，50％及33％饱和硫酸铵各盐析1次，   PH7.2PBS透析去盐，体积浓缩至30％；(3)过Sephadex G200柱，PH8.0 0.2M Nacl-0.1Mtris缓冲液洗   脱，分管收集，第二峰为IgG；(4)双扩散法鉴定IgG纯度；(5)10mM疏基乙醇4℃ 3h解离轻链，对PB透析24h；(6)再过Sephadex G200柱，洗脱液同上，收集第一峰IgG(r)链；(7)双扩散鉴定r链特异性；(8)光密度法测定IgG(r)浓度；(9)抗r链特异性抗体的制备；(10)1mg/ml r链加等量福氏完全佐剂研钵中研磨乳化；(11)每只兔颈背部多点注射3mg r链抗原，2周-1个月1次，共

5-8次，双扩散效价达1∶64以上时采集血清；(12)辛酸法纯化抗血清IgG部分蛋白定量；四、酶标记抗体制备

兔抗人IgG(r)用过碘酸钠法与辣根过氧化物酶偶联对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存，效价＞1∶1000(用方阵滴定法测定)；五、酶标记兔抗人IgG(r)浓度测定

采用方阵滴定法选择酶标记抗体工作浓度为1∶2000六、预包被抗原板及试剂盒原料的制备(10包被

Na₂CO₃        0.6g

Na₂HCO₃       1.58g

重蒸水          500ml

加入适量CoxB病毒1-6分型6型抗原，分别调整PH至9.5加入各型板条各孔中，置湿盒中加盖，4℃过夜后甩干；(2)洗涤

Tris            2.42g

重蒸水          1000ml

加入板条各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复3次，以除去剩余抗原；(3)封闭

蔗糖            100g

羊血清          25ml

0.1MPBS         1000ml

加入各型板条各孔中放入湿盒中(加盖)37℃2h，弃去液体，吸水纸上拍干重复一次，待干燥后，放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃；(4)阳性对照制备

诊断心肌炎患者的血清，60℃放置1小时，除菌过滤，用本试剂盒测定A值＞0.8备用，分装；(5)阴性对照的制备

正常人血清用本试剂盒测定A值0-0.09用万分之二硫柳汞防腐备用分装；(6)酶标记抗体配制

                      30％小牛血清

兔抗人IgG(r)-HRP      50％0.15MPBS

(稀释度1∶2000)       20％甘油

                 ——————————→稀释20倍分装(7)酶标记抗体稀释液

小牛血清           30ml

0.15MPBS           50ml

甘油               20ml

20％Tween-20       2.5ml

调PH至7.2(8)显色剂A

Na₂HPO₄.12H₂O  1.7g

柠檬酸.H₂O        0.5g

3％H₂O₂          200ul

重蒸水             100ml

调PH至5.0(9)显色剂B

EDTA               17.5mg

柠檬酸.H₂O        0.5g

重蒸水             100ml

加入10mlDMSO含60mg TMB的溶液25ul(10)终止液

浓H₂SO₄             10ml

蒸馏水                80ml(11)20X洗涤液

Tris                  4.84g

重蒸水                100ml七、半成品的检定(1)包被板的检定：CV(％)＜10％(n-10)(2)稳定性检定：①阴性对照和阳性对照+4℃-+8℃的稳定性检定

试剂盒内设定阴性对照及阳性对照均+4℃-+8℃放置9个月，再用该试剂盒测定吸光度在正常范围内；②试剂盒37℃稳定性检定

装配前一星期将兔抗IgG-HRP(1+100)(同一批CoxB病毒1-6型用IgG-HRP各检测一次)置37℃，并于第1天，第3天，第5天，第7天各测定一次，并用兔抗人IgG-HRP置-20℃作对照，测得质控血清7天基本不变，则可以使用；(3)特异性检定：

用69份质控参比血清来检测半成品，阴性参比血清允许出现阳性1份，阳性参比血清允许出现阴性1份；

阴性质控血清45份组成：T1-3：HAV抗体阳性血清，T4-6：HCV抗体阳性血清：T7-9：HEV抗体阳性血清，T10-14：HBV表面抗体阳性血清，T15-24：CoxB-IgM阴性血清，T25-27：类风湿因子阳性血清，T28-30：TB阳性血清，T31-33EBV阳性血清，T34-36CMV阳性血清，T37-39Hopl阳性血清，T40-42抗核抗体阳性血清，T43-45TOXO阳性血清，用6型IgG包被板测定；45份特异性血清应允许1份为阳性；

阳性质控血清24份组成：Y1-24阳性血清(CoxB-IgG1-6型每型阳性血清4份)，24份阳性血清，应允许1份为阴性，其余23份应检测为阳性；(4)灵敏度检定①组成：

将中和实验效价高之CoxB-IgG阳性血清选择3份，分别编号为：L1#、L2#和L3#；L1#按以下稀释度稀释：

1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024L2#按以下稀释度稀释：

1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048L3#按以下稀释度稀释：

1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512②判断标准：

6型对L1#灵敏度应检测到1∶32-1∶64

6型对L2#灵敏度应检测到1∶64-1∶128

6型对L3#灵敏度应检测到1∶16-1∶32(5)精密度测定

将同一样品平行加样10孔，其检测值的1-6型每型1份其变异系数均小于15％(CV％＜15)；(6)酶标抗体稀释液，底物液经过37℃细菌培养试验，发现无菌生   长；八、试剂盒组装(1)上述制备步骤所用试剂用过滤器除菌过滤后超净分装；(2)试剂盒必需有外包装盒，海棉垫，塑料瓶6瓶，eppenkof管2   支，包被板，说明书，内标签纸9张，外标贴纸1张，批号lot/EXP，   48T/96T；九、成品检定(1)物理检查①药盒外包装，标签，批号，规格(48T/96T)有无遗漏；②药盒内试剂瓶完整无渗漏，试剂瓶数和说明书无欠缺，标签完整，  有效期应清楚明晰；③药盒试剂(酶标抗体稀释液，显色剂A，显色剂B，洗涤液)核  对PH值及溶液是否澄清；(2)稳定性检定：完全同半成品检定(3)特异性检定：完全同半成品检定；(4)灵敏度：完全同半成品检定；(5)精密性：完全同半成品检定；(6)抽样合格后，留下5个试剂盒剩余入库；

3个试剂盒

4℃  2个  隔一个月测定1次

37℃ 1个  第一次隔三天测定1次，以后每星期测定1次，记

          录数据，绘制图表；

2个试剂盒留库备查十、保存与有效期

保存于2-8℃，自检定后合格之日起有效期为8个月。