[发明专利]相辅脱氧核糖核酸的合成方法

说明书

本发明涉及一种相辅脱氧核糖核酸(cDNA)的合成方法。

cDNA在正常的生物体细胞内并不存在，cDNA需借助于逆转录酶以信使核糖核酸(mRNA)为模板在试管内合成，合成后的cDNA为信使核糖核酸的拷贝，因而带有该信使核糖核酸的全部遗传信息，是当今基因克隆、分析(包括基因芯片)及功能蛋白质表达的必不可少的中介物质。

稳定和实用的cDNA为双链结构，其第一链合成是如上所述的逆转录酶完成的，其第二链的合成可分为两大类：

1)用传统的(非耐热的)聚合酶合成cDNA第二链(如大肠杆菌DNA聚合酶I全酶或Klenow片断，T4、T7λ噬菌体DNA聚合酶等)。

2)用多聚酶链式反应(PCR)合成cDNA第二链，PCR用酶都是耐热性的DNA聚合酶，如Taq，Klentaq，Tth等DNA聚合酶。

众所周知，用传统的聚合酶合成cDNA第二链的保真性好但合成量低，一般为起始信使核糖核酸模板量的80％-90％，而用多聚酶链式反应(PCR)扩增合成cDNA第二链易产生点变异(PCR酶的保真性差)，但由于PCR扩增，双链cDNA为传统方法的10-20倍，这种生产量可以满足工业化大生产的要求，其中由于PCR所产生的点变异，在某些应用(如cDNA芯片的生产)上可忽略不计，或可以用低循环PCR降低或去除PCR酶产生的点变异，虽然低循环PCR(3-5循环)的得率(合成量)要比标准PCR(25-30循环)低得多，但还是比用传统的聚合酶合成cDNA第二链的得率还是高。

把PCR技术应用到cDNA合成必然会碰到的技术问题是如何把PCR引物衔接头，又称“通用序列”无差异地加到每一个cDNA分子上去？众所周知，天然的信使核糖核酸(mRNA)分子存在3’端poly(A)尾部，因而用oligo(dT)转录成第一链的cDNA后，自然在其总体cDNA的5’端形成一个天然PCR通用序列，欲施行总体cDNA PCR扩增，必需在5’端和3’都具有供引物结合的通用序列，如何在数以万计的总体第一链cDNA的3’端高效加上一个PCR通用序列是一个技术难点，现有技术，如末端转移酶催化的同聚物GC加尾，由于无法控制加尾长度，而且GC富集区本身会抑制PCR反应，故实用过程中不理想，用连接酶催化的磷酸接头的连接反应，对单链DNA的连接效果极差，对双链DNA的连接亦不稳定，而且连接反应中如存在非mRNA污染序列，会在以后的PCR反应中得到扩增影响到cDNA的纯度，所以连接反应所需要的起始物为mRNA，而且使用量亦大。

本发明的目的在于提供一种可在全部第一链cDNA的3’端简易、高效加上一个PCR通用序列，进而实现总体cDNA PCR扩增的cDNA的合成方法。

本发明的技术解决方案是：

一种cDNA的合成方法，其特征在于：包括下列步骤：

(1)用常规方法人工合成下列结构式的DNA-RNA或RNA供体分子：

5’-----------------^****3’，包括

①5’OOOOOOOOOOOOOO-GNGG3’

②5’OOOOOOOOOOOOOO-NGGG3’

③5’OOOOOOOOOOOOOO-NNGG3’

④5’OOOOOOOOOOOOOO-GNG3’

⑤5’OOOOOOOOOOOOOO-GGN3’

⑥5’OOOOOOOOOOOOOO-NGG3’

其中Poly＂O＂代表随意DNA或RNA序列，包括25～35个碱基，是引物的结合部位；“G”代表RNA碱基G，“N”代表RNA碱基：A或T、G、C；

(2)用鼠源逆转录酶M-MLV采用常规方法以mRNA为模板合成第一链cDNA，在合成第一链cDNA的同时，加入上述供体分子，发生如下方式的逆转录和模板转换反应：当合成第一链cDNA到达mRNA的5’端，第一链cDNA在3’端具有加尾功能而形成的cDNA受体分子，通过分子相辅结合，该受体分子接受反应液中的供体分子，逆转录酶继续把供体分子作为模板继续转录而合成一条和供体分子相辅的序列，即PCR通用序列，也即PCR引物结合部位；  5’---------^****3’供体分子