[发明专利]人源性肝细胞生长刺激因子cDNA克隆和序列

说明书

本发明涉及人源性肝细胞生长刺激因子cDNA克隆和序列。

自1975年LabrecgueDR首次分离到肝脏刺激因子以来，近20多年的研究中发现了多种有促肝细胞生长因子(PHGF)、如肝脏刺激生长因子(HSS)及肝再生增强因子(ALR)等促肝细胞生长的物质。我国学者苏先狮等人从乳猪肝组织中抽提得到的肝细胞DNA合成刺激因子(HDSSF)被证实有很强的刺激受损肝细胞增殖作用。已经用于治疗严重肝炎，并在临床应用中表现出很好的降低谷丙转氨酶、胆红素、球蛋白(G)、升高血浆白蛋白(A)，改善A/G比值功效，并测出了部分氨基酸序列。为了证明该物质的本质及探讨人源性HDSSF，根据同源克隆的原则，合成简并引物，通过cDNA文库筛选，获得单个克隆，完成了编码区核苷酸全部序列。

本发明的目的就是提供人源性HDSSF cDNA克隆序列。

本发明采用从乳猪肝组织中纯化的肝脏刺激物质的部分氨基酸序列，合成简并引物，依据同源克隆的原则，利用简并PCR技术从人胎肝cDNA文库扩增出目的片断，并以此为探针进行核酸杂交筛选人胎肝cDNA文库，从而获得目的基因，其cDNA链为792bp，含有594bp的完整开放续码框架和5’及3’末端非编码序列，该序列显示HDSSF为一个含有198个氨基酸残基。测出的序列是一种不同于其他因子的物质：AAAAGCTGTA  GTGGGTTTGT  AGCCAGGATG  ACAGCGGTACCTTAACACAG  TCCCAACAAC  ATACACATCC  TCTTTTGTCGGCCTAGGATA  TGTTTCCCAG  GAAGCATGTG  GAATGTCTGGTAAATTAATA  CAACTATTGG  GCTCACAAGC  AGGAGGAGAAGGATTCCATT  TGCTATCAGC  ATCACAATGA  ATTACACTGCTGCCTCTGAG  AACAAAACC   TTTTTGGCAC  TTAAACACAATAGTGTCTTT  GTAATTATAG  ATGGGTCCAA  ATCCAGAGACCATTTCCCCA  TGTGAAACAT  CTGGCTTGCG  ACAGGTGATTTTTTCACAGG  TAGGAGGGCTT GGTCTCCAAA  CGCCTATTGTTTCATTCTCC  ACAGTGCAAG  AAATGGAGGC  ATGGCCCAAGAGTGAGAAGC  GGGGGTCACA  GCTGTAGGTG  ACAGAAAAGCCGTATGCGTA  GAAATTTTCT  TCACCGCTGT  GCCTTCCATTCCTGATGTCT  GGAGGAGGCT  TACACTTGAC  AATTTCACATTGTGGGAGAG  GATGACTCCA  GCCAACTCCT  CTATCTTGGACTTCACAACG  ACTAGTGGTT  GAGCCAATTA  AGAAAAA

附图说明：

图1为人HDSSF基因核苷酸序列图。

人HDSSF基因核苷酸序列分析结果见附图1。

本发明是通过以下方法获得的：

1.质检、宿主菌及人胎肝cDNA文库：pGEM-T easy vector及E.coli JM109购自Promage公司；人胎肝cDNA文库购自sigma公司。

2.尼龙膜：购自美国杜邦公司。

3.简并引物设计：根据原测定的乳猪肝抽提物HDSSF，N末端氨基酸部分序列设计上游简并引物：5’-GANGANAANTCNTTNAANTGGAANGC-3’，并依据mRNA的特性，确定其下游引物。

4.HDSSF探针制备：以cDNA文库为模板进行PCR扩增。反应完成后以1％琼脂糖凝胶电泳，检查有无目的条带。

5.探针的回收与标记：由于HDSSF的分子量为21000道尔顿，估计其读码框为600bp左右，因此在凝胶上切下600bp条带回收，按试剂盒方案以地高辛标记探针。