[发明专利]一种双效工程菌生物杀虫剂及其生产方法

权利要求书

1.一种双效工程菌生物杀虫剂，其特征在于该生物杀虫剂是一种产生Bt毒蛋白和经基因克隆后产生蛛毒蛋白的苏云金杆菌工程菌制剂，该制剂的苏云金杆菌工程菌的活芽孢含量在80-100亿/ml，制剂的效价在6000国际单位/μg以上，制剂对鳞翅目、双翅目与鞘翅目的幼虫杀虫率达90-96％。

2、按权利要求1所述的双效工程菌生物杀虫剂，其特征在于该生物杀虫剂在苏云金杆菌工程菌质粒上携带Bt毒蛋白基因有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ax、cry1Cb与cry2Ac，苏云菌杆菌工程菌携带的蛛毒蛋白基因有HWTX-I、HWTX-II(α亚基)、HWTX-II(β亚基)、Raventoxin-I、Raventoxin-II、Atracotoxin-Hvlc、delta-atracotoxin-Hvl、omega-actx-hvla、mu-agatoxin I～VI、Alpha-latroinsectotoxin与delta-latroinsectotoxin。

3、一种如权利要求1所述的双效工程菌生物杀虫剂的制备方法，其特征在于生物杀虫剂的制备由苏云金杆菌工程菌的构建与苏云金杆菌工程菌剂的生产两部分组成：

(1)苏云金杆菌双效工程菌的构建

①构建可调控表达载体

——受体菌为苏云金杆菌4.0718菌株以及苏云金亚种、库斯塔克亚种、蜡螟亚种、武汉亚种与中华亚种，

——质粒pXLZ401构建，用Triton X-100温和法抽提菌株4.0718总质粒，在Pst I/BamH I双酶切以后，得到4Kb左右的基因片段，用琼脂糖凝胶电泳分离纯化，另用Pst I/BamH I双酶切穿梭载体pHT3101，得到带有两个不同粘性末端的链状DNA。用碱性磷酸酶去磷酸化，将分离纯化的4Kb左右的基因片段与去磷酸化的载体pHT3101混合，用T₄DNA连接酶连接，产生质粒pXLZ401，

——ICPs基因强启动子及SD序列的获取，电转化质粒pXLZ401的无晶体突变株，通过红霉素平板筛选转化子，通过革兰氏染色镜检选择产生晶体的转化子，在LB培养基上活化、培养转化子，用TritonX-100提取质粒，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，用pst I/BamH I双酶切或双酶切后通过CsCl密度梯度离心，Glass-milk法获得带有完整的ICPS开放阅读框的片段，将片段测序后用计算机软件对序列进行分析，确定其启动序列及SD序列，

——质粒pXLZ402的构建，上述片段通过PCR扩增起始密码子ATG前的全长启动序列，并在5’端和3’端分别加上ECoR I、Sal I位点，经纯化，用ECoR I/Sal I双酶切。载体pHT3101同样用ECoR I/Sal I双酶切，用碱性磷酸酶去磷酸化，两者混合，用T₄DNA连接酶在ATP存在的条件下将两者连接起来，形成质粒pXLZ402，转化E.coli DH_5α中扩增；

②蜘蛛特异昆虫神经毒素基因的化学合成及domain II序列的获取

——蛛毒基因的化学合成，依据蛛毒基因序列采用化学合成方法，合成毒素多肽全长基因，在基因的5’端和3’端分别带有ECoR I、Xba I位点，同时在3’端另加终止密码子TGA，

——ICPs中作用于昆虫肠细胞膜受体的domain II序列的获取，在Gene Bank中查找已有的ICPs domain II序列。通过序列分析软件，阵列比较保守区，并与测序片段比较。根据保守区确定其domain II边界，用化学合成和PCR方法获得domain II基因片段，分别在5′端和3′端带有Sal I、ECoR I酶切位点，在5′端另加起始密码子ATG，通过PCR即可获得domainII区段，

——质粒pXLZ403的构建，用碱裂解法提取质粒pXLZ402，用Sal I/XbaI双酶切后，用碱性磷酸酶去磷酸化，另将已获得的domain II序列用EcoR I酶切后，与化学合成的在5′端带有EcoR I位点的毒素基因混合，用T₄DNA连接酶连接，在连接片段纯化后，用Xba I酶切并与去磷酸化的链状质粒pXLZ402混合，用T₄ DNA连接酶连接，形成质粒pXLZ403，转化无质粒突变株，通过红霉素平板选择转化子；

③将带有启动序列的融合蛋白基因整合到Bt菌DNA上稳定遗传

——质粒pXLZ404的构建，将野生型转痤子Tn5401两端用核酸外切酶去除转座酶识别的边界，用酶切的方法删除转座酶，纯化剩余片段，用T₄DNA连接酶连接，插入到pHT3101中，形成质粒pXLZ404，转入E.coli DH_5α中扩增，

——质粒pXLZ405的构建，用Triton X-100温和法分别提取质粒pXLZ403、pXLZ404，分离纯化pXLZ-2-重组片段，插入到pXLZ404中删除了转座酶的位点上，用酶切去除质粒pXLZ404中的Bt复制子，产生质粒pXLZ405。用电转化、基因枪或金属离子诱导法转化E.coli DH_5α中扩增，氨苄青霉素平板选择转化子，

——质粒pXLZ405整合到菌株4.0718的染色体上，将野生型转座子Tn5401转入苏云金杆菌4.0718的染色体上，产生新菌株，将质粒pXLZ405电转化新菌株，改造后的Tn5401及全长融合基因整合到已存在于染色体上的野生型转座子Tn5401中，用红霉素平板选择转化子；

(2)苏云菌杆菌工程菌剂的生产

①菌种活化，保藏的工程菌菌种经斜面培养后，转接于扁瓶培养基中，在28～35℃条件下，培养30～48h，配成孢子液，以5％的接种量用于种子罐接种，

②种子罐发酵，将孢子液接入经灭菌并装有培养液的一级种子罐中，通入无菌空气培养，得到一级种子罐发酵菌液，按5％～8％接种量将一级种子发酵液转入二级种子罐培养液中，通入无菌空气和搅拌培养，得到二级种子罐发酵菌液，

③发酵罐培养，按5％～8％的接种量将二级种子罐发酵液转入发酵罐中，在25℃～30℃温度条件下，通入无菌空气培养42～48h，

④浓缩，发酵罐发酵结束后，将菌液经超滤浓缩，补加增效添加剂，装瓶。