[发明专利]人造血细胞相关基因－1

说明书

一.研究领域本研究涉及人造血细胞分化相关基因-1(以下称Hemagene-1)基因全长cDNA的分子克隆及功能研究。通过构建原核表达载体并转化合适的原核宿主细胞获得表达蛋白质；通过构建真核表达载体并转染合适的宿主细胞，经筛选后获得稳定表达Hemagene-1的细胞株，稳定表达Hemagene-1的细胞发生恶性转变，表明该基因具有转化活性；该基因在白血病细胞高表达，可能应用于白血病细胞的诊断，或成为筛选抗白血病药物的新靶点。

二.国内外相关研究

众所周知，基因的选择表达决定了细胞的分化、发育、增殖和死亡等最基本的生命现象，研究胚胎阶段基因选择性表达即基因特定时相的开或关是了解不同发育阶段生理功能调控的关键。在脊椎动物胚胎发育过程中，肝脏有非常特殊的历程。早期的胚胎肝脏具有非常旺盛的增殖和分化能力，同时又是人体重要的造血器官，大约在出生前人体才由肝脏转为骨髓造血。因此，此阶段的肝组织既表达丰富的造血调控基因，也表达肝脏生长发育的调控基因。以往的研究表明从四月龄人胎肝组织中可发现和分离许多重要基因如：肝再生增强因子(1)，丝/苏氨酸激酶(2)和其它未知基因(3)等。基于上述理由，比较胚胎肝和成人肝基因表达差异有望发现重要调控基因。

三.本发明总结

本发明通过代表性差异显示分析技术(Represention DifferentialAnalysis，RDA)，比较了四月龄人胎肝组织及正常成人肝组织基因表达的差异，首次成功地分离出人胎肝特异表达基因，命名为Hemagene-1，全长cDNA，Hemagene-1基因全长2166bp，包括110bp 5’-非翻译区序列，602bp 3’-非翻译区序列。该基因编码484氨基酸组成的蛋白质，分子量为55.3kd。该基因具有转化活性，高丰度表达在白血病细胞，可能应用于诊断和治疗白血病。

本发明发现了一种新基因，利用分子生物学技术首次提供了Hemagene-1的全长c DNA序列及其生物学功能。

本发明提供了Hemagene-1编码的蛋白质氨基酸序列。

本发明提供了一种重组生产人Hemagene-1的方法，提供了一种含有Hemagene-基因的原核表达载体，利用它可以大量得到Hemagene-1蛋白。

本发明提供了一种含有Hemagene-1基因的真核表达载体及获得稳定表达Hemagene-1的细胞株，利用它可以得到Hemagene-1多肽。

四.主要图表说明

为了更好地理解本研究内容，下面对主要附图加以说明：

图1显示Hemagene-1的基因组结构

图2显示构建的体外翻译载体；

图3显示体外翻译结果

图4显示PCR检测Hemagene-1mRNA在不同组织中的表达

表5显示PCR检测Hemagene-1在白血病患者外周血细胞的表达

图6显示Northern杂交检测Hemagene-1mRNA在不同肿瘤细胞株中的表达

图7显示GFP-Hema融合表达载体的构建

图8显示GFP-Hema融合蛋白在COS-7细胞中的表达

图9显示Hemagene-1真核表达载体的构建

图10显示Hemagene-1反义真核表达载体的构建

图11显示Hemagene-1缺失体真核表达载体的构建

图12显示检测Hemagene-1表达载体转染NIH3T3细胞后，Hemagene-1mRNA

在不同细胞株中的表达

图13显示经G418筛选获得稳定表达细胞株的表型变化；

图14显示稳定表达Hemagene-1细胞株侵袭性增加

图15显示融合表达载体的构建

图16显示Hemagene-1在大肠杆菌中的融合表达结果

五.详细描述  1.RNA提取

用Trizol(Life Technologies，Inc.)分别提取四月龄人胎肝组织和正常成人肝组织总RNA如下，50-100mg肝组织加1mlTrizol，匀浆后在25-30放置5min，加入0.2ml氯仿/1mlTrizol，剧烈震荡15min，取上层水相移入一新的EP管，加入0.5ml/1mlTrizol异丙醇，15-30沉淀10min，然后2-8，1200g离心10min，加入1ml 75％乙醇/Trizol洗涤一次，2-8，7500g离心5min，半干燥RNA，加入50ul无RNA酶去离子水，紫外分光光度计下计OD260/OD280接近2.0。2.差异片段的分离