[发明专利]棒状细菌的精氨酸阻遏物缺陷型菌株和制备L－精氨酸的方法

说明书

本发明涉及一种能制备L-精氨酸的棒状细菌以及利用该细菌制备L-精氨酸的方法。L-精氨酸是一种工业上有用的氨基酸，其作为肝功能促进剂、氨基酸输注剂、广泛的氨基酸药物等的成分。

常规的经发酵制备的L-精氨酸是利用下列棒状细菌得到的：棒状细菌的野生型菌株；对某些试剂(包括磺胺类药、2-噻唑丙氨酸、a-氨基-a-羟基戊酸等)有抗性的棒状细菌；除了对2-噻唑丙氨酸有抗性，而且对L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸或L-色氨酸表现为营养缺陷型的棒状细菌(日本专利待审公开54-44096)；对酮丙二酸、氟代丙二酸或一氟乙酸具有抗性的棒状细菌(日本专利待审公开57-18989)；对精氨醇(argininol)具有抗性的棒状细菌(日本专利待审公开62-24075)；对X-胍具有抗性的棒状细菌(X表示脂肪酸的衍生物或脂族链，日本专利待审公开2-186995)等等。

另一方面，现有技术还公开了利用重组DNA技术制备L-精氨酸的方法。即公开了利用棒杆菌或短杆菌属的微生物制备L-精氨酸的方法，其中使得所述细菌携带有包括载体DNA和含有以下基因的DNA片段的重组DNA，所述基因为：来自属于埃希氏菌属微生物的乙酰鸟氨酸去乙酰基酶、N-乙酰谷氨酸-a-半醛脱氢酶、N-乙酰谷氨激酶(glutamokinase)和精氨琥珀酸酶(日本专利公开5-23750)。

另外，至于棒状细菌，已经知道L-精氨酸生物合成体系的某些酶的合成受到L-精氨酸的抑制。而且，据报道，在L-精氨酸生物合成体系的某些酶受到L-精氨酸抑制的同时，在棒状细菌的突变株中取消了L-精氨酸对这些酶的抑制，而显示出L-精氨酸积累量的增加(Agric.Biol.Chem.，43(1)，105，1979)。

同时，对于大肠杆菌，L-精氨酸生物合成体系的阻遏物和编码该阻遏物的基因被鉴定(美国科学院学报(1987)，84(19)，6697-701)，还研究了该阻遏物蛋白质的结合相互作用和L-精氨酸生物合成体系的各种基因(美国科学院学报(1987)，84(19)，6697-701，分子生物学杂志(1992)，226，367-386)。

但是，在棒状细菌中还没有确定L-精氨酸生物合成体系的任何阻遏物蛋白质。尽管在该阻遏物蛋白质基因(argR)的核苷酸序列和推测由其编码的氨基酸序列登记在基因数据库GnBank(AF049897)中，但该基因被命名为argR是因为在上述氨基酸序列和已知的精氨酸阻遏物之间有同源性。

如上所述，尽管研究了棒状细菌的L-精氨酸生物合成体系的阻遏物蛋白质及其基因，但是该阻遏物蛋白质本身还未被确定，而且其功能等也根本没有阐述。因此，本发明的一个目的是确定棒状细菌中的L-精氨酸生物合成的阻遏物，提高棒状细菌的L-精氨酸的生产率。

本发明的发明人从棒状细菌中分离出在基因数据库中以argR登记的基因(Genbank登记号为AF049897)的同系物，并且发现如果该基因在棒状细菌中被扩增，L-精氨酸的生产能力将下降，另一方面，如果破裂了该基因，L-精氨酸的生产能力将增加，由此证实了L-精氨酸生物合成受到棒状细菌(如大肠杆菌)中的阻遏物和上述编码该阻遏物以argR登记的基因的抑制。因此，本发明得以完成。

本发明提供了以下的内容：

(1)一种棒状细菌，其中精氨酸阻遏物不以通常的方式发挥作用，并且其具有L-精氨酸生产能力。

(2)如(1)所述的棒状细菌，其中由于该细菌染色体上编码精氨酸阻遏物的基因的破裂，精氨酸阻遏物不以通常的方式发挥作用。

(3)如(2)所述的棒状细菌，其中精氨酸阻遏物具有在SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列或者表现出与该氨基酸序列同源的氨基酸序列。

(4)一种制备L-精氨酸的方法，包括在培养基中培养如(1)至(3)中任一项所述的棒状细菌，以在该培养基中产生和积累L-精氨酸，并且从该培养基中收集L-精氨酸。

在本发明中，“精氨酸阻遏物”指的是一种具有抑制L-精氨酸生物合成作用的蛋白质，如果编码该蛋白质的基因的表达量在棒状细菌中增加，L-精氨酸的生产能力将下降，如果该表达量下降或该蛋白质消失，那么L-精氨酸生产能力将增加。此后，编码该精氨酸阻遏物的基因也被称为argR基因。另外，用于本发明的“L-精氨酸生产能力”指的是，当本发明的微生物在培养基中培养时，其在该培养基中积累L-精氨酸的能力。

根据本发明，具有L-精氨酸生产能力的棒状细菌的L-精氨酸的生产能力得到提高。

图1表示质粒pK1的构建过程。

图2表示质料pSFLK6的构建过程。