[发明专利]生产目的发酵产物的方法

权利要求书

1.用于生产目的发酵产物的方法，包括：

(a)提供含有重组产生的如下微生物的发酵培养基，所述微生物超量产生目的发酵产物并含有引起该微生物营养缺陷型生长的突变，其中该微生物中的所述营养缺陷并不损害该微生物产生所述目的发酵产物的能力；和

(b)给所述培养基提供对于所述目的发酵产物的产生所必需的所有底物、该目的发酵产物的底物、和补充所述营养缺陷的底物。

2.根据权利要求1的方法，还包括从所述微生物和/或所述发酵培养基分离所述目的发酵产物。

3.根据权利要求1或2的方法，其中以足以维持生物质以一定生长速率生长的浓度向所述发酵培养基提供补充所述营养缺陷的底物，而以不限制所述微生物产生所述发酵产物的能力的浓度向该发酵培养基提供对于该发酵产物的产生所必需的底物。

4.根据权利要求3的方法，其中所述靶发酵底物与补充所述营养缺陷的底物之比是从1∶10,000,000至1∶10，尤其是从1∶1,000,000至1∶100。

5.根据权利要求1-4之任意一项的方法，其中所述目的发酵产物选自核黄素、泛酸、硫胺素、叶酸、吡哆醇和氨基酸。

6.根据权利要求1-4之任意一项的方法，其中所述微生物含有一个或多个拷贝的编码具有产生核黄素之酶活性的多肽的多核苷酸序列，并含有一个或多个天然情况下不与所述微生物中的所述多核苷酸序列相关、但现在与所述微生物中的所述多核苷酸序列在转录上相连的转录元件。

7.根据权利要求6的方法，其中所述转录元件包含至少一个启动子。

8.根据权利要求1-7之任意一项的方法，其中所述微生物中的所述营养缺陷选自生物素、腺嘌呤、色氨酸、赖氨酸和其组合的缺陷。

9.根据前述权利要求之任意一项的方法，其中所述补充所述营养缺陷的底物是生物素，而所述发酵产物的底物之一是葡萄糖。

10.根据权利要求9的方法，其中所述微生物是生物素营养缺陷体，而所述目的发酵产物是核黄素。

11.权利要求1-10之任意一项的方法，其中所述微生物选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、蓝细菌属、链霉菌属和棒杆菌属，尤其是选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌和产氨芽孢杆菌。

12.根据权利要求1-10之任意一项的方法，其中所述微生物是枯草芽孢杆菌，尤其是RB50：：[pRF69]Bio^-或其保留了超量产生核黄素的能力的衍生物。

13.在发酵培养基中使目的发酵产物的产生与生物质的产生脱偶联的方法，包括：

(a)提供重组产生的微生物，所述微生物经改造含有编码目的发酵产物生物合成酶的多核苷酸序列，所述目的发酵产物的最大取决于非限制地供应目的发酵产物的底物；和

(b)将营养缺陷引入所述微生物中，以便通过限制发酵培养基中补充该营养缺陷的底物的浓度来控制生物质的产生。

14.根据权利要求13的方法，其中步骤(b)包括将含有缺失-插入突变的多核苷酸引入所述微生物的基因组中，以破坏所述微生物产生对于生物质产生所必需的化合物的能力。

15.根据权利要求14的方法，其中所述多核苷酸在bioFDB基因盒中含有缺失-插入突变。

16.根据权利要求13-15之任意一项的方法，包括用含有bioFDB缺失-插入突变的多核苷酸序列或含有SEQ ID NO：1的多核苷酸序列转化所述微生物。

17.根据权利要求13-16的方法，其中所述目的发酵产物是核黄素。

18.通过权利要求13-16之任意一项的方法提供的微生物。

19.多核苷酸序列，其选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的引入营养缺陷的同系物，和SEQ ID NO：1的含有插入、缺失和替换并保留了在宿主细胞中引起营养缺陷的能力的多核苷酸序列。