[发明专利]一种血栓靶向性溶栓蛋白表达质粒及其构建

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及用基因工程方法制备血栓靶向性溶栓蛋白表达质粒。

背景技术

血栓症，如急性心肌梗塞(AMI)、静脉血栓栓塞等是一类严重危及人类健康及生命的心血管疾病。在西方国家，因血栓引起的死亡已占人口总死亡率的首位。在我国，随着经济发展和人口趋向老龄化，血栓症患者日益增多，对抗血栓药物的需求也越来越大。目前临床上常用的溶栓药物主要为纤溶酶原激活剂，如链激酶(SK)、尿激酶(UK)、单链尿激酶(scu-PA)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)等，这些药物虽然都具有较强的溶栓效果，但均存在许多缺点：(1)出血：由于这些药物不仅激活纤维蛋白凝块中的纤溶酶原，同时也激活血浆中的纤溶酶原，使血浆中纤溶酶活性增高。血浆纤溶酶水解凝血因子VII等，从而使凝血因子减少而引起出血。(2)体内半衰期短，治疗用量大。(3)再梗死：纤溶系统被激活后可活化血小板，使纤维蛋白原和VonWillebrand因子聚集于血小板GpIIb/IIIa受体，促使血栓形成。因此溶栓后短时间内容易再次形成血栓，使治疗失败。

低分子量单链尿激酶(scu-PA(144～411))是单链尿激酶(scu-PA)的衍生物，由scu-PA的144～411位氨基酸残基组成，其溶栓性质和scu-PA类似，出血副作用较小，但缺乏对纤维蛋白的特异亲和力，因而溶栓的效率不高，临床的应用受到限制。

因此，开发新型的效力更强、溶栓专一性更好、并能有效预防再栓塞的溶栓制剂是目前抗血栓药物研究的热点。

发明内容

本发明者曾从猪囊尾蚴cDNA文库中克隆到的一个新基因——膜联蛋白32(Anx 32)基因(孙树汉等，囊虫病诊断用抗原编码cDNA的分子克隆，中国寄生虫学与寄生虫杂志，1997，15(1)：15-20)。该基因编码347个氨基酸的蛋白质，分子量38KDa。在钙离子存在的情况下，膜联蛋白32可以高亲和性、特异性地与酸性磷脂结合。血液凝固过程可以分为三个阶段：(1)血小板活化阶段。血小板磷脂膜的不对称性发生改变，原来居于质膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)暴露。(2)血小板表面反应阶段。从凝血因子X到凝血酶的形成，此系列反应均需在血小板膜的表面进行。(3)纤维蛋白形成阶段。凝血酶使纤维蛋白原转变成为纤维蛋白。由于膜联蛋白32可以高亲和性地结合活化血小板的膜磷脂，因而可以竞争性抑制凝血因子的激活，起到抗凝血的作用。

在此基础上，本发明人进行了膜联蛋白32与scu-PA(144～411)融合表达研究，完成了本发明。

本发明提供一种融合基因anx32-scuPA，所述融合基因包含序列表中序列1所示的编码膜联蛋白32的基因和序列3所示的编码单链尿激酶144～411位氨基酸的基因的融合物。

本发明还提供一种热诱导型表达质粒pJM-anx32-scuPA，所述表达质粒为长度6.8Kb的环形双链，克隆有编码膜联蛋白32和单链尿激酶144～411位氨基酸的基因序列，并含有P_RP_L启动子。

本发明进一步提供一种工程菌K802(pJM-anx32-scuPA)，为大肠杆菌K802JLF1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M201020。

本发明的融合基因anx32-scuPA是通过如下步骤进行制备的：将序列1所示编码膜联蛋白32的基因和序列3所示编码单链尿激酶144～411位氨基酸的基因分别用PCR方法扩增；然后采用重叠区延伸法连接。

本发明的表达质粒pJM-anx32-scuPA的构建，系将融合基因anx32-scuPA用EcoRI、SalI双酶切，然后与用EcoRI、SalI双酶切的载体pJM连接。

本发明人构建的膜联蛋白32和scu-PA(144～411)的融合表达质粒能融合表达膜联蛋白32与scu-PA(144～411)，表达产物能保留各自的生物学活性，从而可得到一种具有抗凝和溶栓双重功能的新型溶栓药物。前已述及，现有溶栓药物主要通过活化纤溶酶来溶解血栓，而血小板对纤溶酶的作用不敏感，因而这些药物对富含血小板的血栓治疗效果较差。而膜联蛋白32除了本身具有的抗凝血功能外，因其特异性结合活化的血小板，所以可将scu-PA(144～411)靶向性地结合在血栓部位，从而可以大大提高对富含血小板的动脉血栓的治疗效果。