[发明专利]一种耐多药结核分枝杆菌的分泌产物及其应用

说明书

技术领域

本发明属生物医药技术领域，具体涉及一种耐多药结核分枝杆菌的分泌产物及其应用。

技术背景

目前，结核病仍是威胁我国人民健康的严重传染病。其致病菌结核分枝杆菌的耐药性日益严重。控制结核病蔓延的必需手段是快速诊断，尤其是耐药性的快速诊断和有效的治疗药物以及预防性和治疗性疫苗。结核分枝杆菌的多种分泌产物在人的血清中出现到抗体。如38kDa，phoS 30 kDa(Ag85B)，16kDa的热激蛋白，LAM以及分子量在2-14 kDa的小分子分泌蛋白，甚至高分子量的蛋白如88 kDa，81 kDa。(Anderson AB.，Hansen EB.，Structure and mapping of antigenic domains of protein antigen b，a 38,000-molecular weightproteins of Mycobacterium tuberculosis.Infect.immun.1989 57：248 1-2488；RowlandSS.，RuchertJL.，Cummings PJ.，Low molecular mass protein pattems in mycobacterial culturefiltrates and purified protein derivatives.FEMSImmunol.med.microbiol.，1999  23：21-25)纯化、鉴定这些分泌蛋白并利用它们来对结核分枝杆菌感染进行血清学诊断已经取得了一定的成功。但都不甚令人满意。主要是不能区分是否耐药，以及获得检测结果所需要的时间长。迄今未见分离耐药细菌的特征性分泌产物以及用这些产物对耐药情况进行血清学诊断的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够鉴定不同耐药结核分枝杆菌的特征产物。

本发明的特别目的在于提供一种鉴定临床分离的同时耐四种药物的菌株的试剂。

本发明提出的耐多药结核分枝杆菌的分泌产物是从同时耐四种抗结核病一线药物的四重耐药结核分枝杆菌菌株的分泌产物中获得。该四重耐药菌株-异烟肼，利福平链霉素和乙胺丁醇，编号DR21。根据HPLC出峰时间判断其极性强，MS检测的分子量大小为689，IR检测含有烷氧基和芳香烃类基团，属于含氧烷基、含有芳香环的脂类化合物。记该特性分汔产物为DR218脂类在结核分枝杆菌中具有特殊的意义。结核分枝杆菌的基因组中有大量的基因编码脂类合成或降解的产物。该细菌和其他细菌的显著差异之一是在细胞壁中含有一系列特殊的脂类，包括枝菌酸、罕见脂类和糖脂、脂蛋白等。这些脂类具有重要的生物活性。在致病中发挥特殊的功能。宿主细胞中也有识别脂类的CTL细胞。

从IR图谱分析，该化合物含有芳香烃基团。分枝杆菌的分泌产物具有该类基团的是分泌型运铁载体。这类载体对于分枝杆菌有特殊的意义。它们是分枝杆菌和宿主细胞竞争体内有限铁资源的重要化合物，是细菌体内外生长必需，同时也被认为是毒力因子。在耻垢分枝杆菌的IdeR突变菌株的触酶-过氧化物酶以及超氧化物酶活性降低，对异烟肼更加敏感。提示铁代谢的调节与氧化应激、异烟肼耐药性之间具有一定联系。但是，具体是哪些分子参与这些事件，没有报道。以往关于结核分枝杆菌耐药性研究往往集中在检测DNA水平突变，罕见从结核分枝杆菌特有的脂类水平进行研究。

本发明首次纯化、鉴定了与耐药有关的特殊分泌产物，是一种含有芳香基团的脂类，确证该化合物具有抑制细胞周期从G1到G0进行的功能。这为今后研究该分子在耐药中的意义以及开发为血清学诊断耐药性的标记提供了依据。    

附图说明

图1  DR218的色谱图箭头指向处为DR218特征性洗脱峰

图2  DR218的质谱分析图谱

图3  DR218的红外吸收光谱

本发明的耐多药结核分枝杆菌的分泌产物的分离方法如下：

菌株及培养    采用临床分离耐药性菌株四耐药性菌株-异烟肼，利福平链霉素和乙胺丁醇，编号DR21(由上海市肺科医院检验科结核分枝杆菌检验室提供，菌株的耐药性由该院结核分枝杆菌检验室的BACTEC TB-460检测和常规药敏检测确证)。细菌在Middlebrook7H10(Difco)添加OADC(0.5％BSA，0.2％glucose，0.06％ oleic acid，140mMNaCl)和0.05％TWEEN-80(Sigma)的液体培养基中，37℃培养。