[发明专利]γ－聚谷氨酸及其盐的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及γ-聚谷氨酸及其盐的制备方法。

背景技术

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)及其盐是一种可生物可降解的高分子物质，可期待在医药、纺织、食品、化妆品、农业等领域广泛应用。

γ-聚谷氨酸可通过传统的多肽合成的方法将谷氨酸单体连接而成，然而，这种方法是没有工业应用价值的，因为聚合谷氨酸过程要经过许多步复杂反应。

另一方面，早在1937年，Ivanovics等人就发现γ-聚谷氨酸是炭疽芽孢杆菌的荚膜成分(Ivanovics G，Erdos Z.Immunt tsforsch，1937，90：5)，1942年Bovarnick等人开始研究采用能在培养基中蓄积γ-聚谷氨酸的微生物来发酵生产γ-聚谷氨酸(Bovarnick M.J Biol Chem.1942，145：415)，自此以后，发酵法生产γ-聚谷氨酸的研究一直在进行(Ito Y et al.Biosci.Biotech.Biochem.96，60：1239-42)，人们相信微生物发酵法较化学合成法更有优势。然而，γ-聚谷氨酸在培养液中的蓄积量很低，工业上大规模廉价生产γ-聚谷氨酸尚有困难，为此希望开发出高效的γ-聚谷氨酸制备方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种高效的γ-聚谷氨酸及其盐的制备方法。

本发明的目的可以通过下列措施来达到：

本发明采用的微生物为芽孢杆菌属菌株，如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，这类菌株具有共同的特点，即在含碳源、氮源、谷氨酸培养基上培养，能生成高活力的γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)，酶活力为1-10U/ml，从而可生成高浓度的γ-聚谷氨酸发酵液，进而用溶剂沉淀或化学沉淀法得γ-聚谷氨酸或其盐。菌株的性状如下：1、形态特征：在肉膏琼脂培养基上营养细胞为0.7-1.0×1.3-2.0μm大小的杆菌，30℃培养2-3天形成芽孢，芽孢大小为0.7-0.9×1.0-1.5μm，为长圆形或圆柱形。2、培养性质：  (1)  肉膏琼脂平板培养：25-45℃培养1-3天可大量生长。菌落呈污白色，

粗糙有皱褶，不透明，不闪光，蔓延，边缘不规则。  (2)  肉膏琼脂斜面培养：同(1)  (3)  肉膏液体培养：在液体表面形成菌膜，液体内部透明。  (4)  肉膏穿刺培养：菌体在表面生长，底部不生长。3、生理性质：  (1)  革兰氏染色：阳性  (2)  硝酸盐还原：阳性  (3)  甲基红实验：阴性  (4)  VP试验：阳性  (5)  柠檬酸盐利用：阳性  (6)  吲哚生成：阴性  (7)  H₂S生成：阴性  (8)  无机盐利用：能以铵盐为唯一氮源生长  (9)  耐NaCl浓度：7％浓度上可以生长

归纳上述，本发明使用的是好气性芽孢杆菌，具体为Bacillus subtilis NX-2和Bacillus licheniformis B-2。

本发明使用的培养基含碳源、氮源、无机盐、谷氨酸或其盐等营养。

本发明对碳源并没有特别的限定，可以使用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、淀粉水解糖、糖蜜等，其中以葡萄糖、麦芽糖较合适。

氮源包括有机氮源如酵母膏、蛋白胨、玉米浆、尿素，也可采用无机氮源如(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、NH₄Cl，上述氮源可单独使用，也可混合使用。

本发明的培养基中使用谷氨酸，浓度为0.5-7％，最好在2-5％，加入量过少，γ-聚谷氨酸生成量减少，甚至完全不产生，但加入量过多，菌体生长变差，发酵液中剩余谷氨酸多，造成浪费。使用的谷氨酸也可以是盐的形式。

本发明采用的γ-聚谷氨酸分离纯化方法包括有机溶剂沉淀法和化学沉淀法。利用离心或絮凝菌体的方法除去发酵液中的菌体，在上清液中加入低级醇类，如乙醇、甲醇，也可以是丙酮，加入量为溶液的2-5倍，沉淀得到γ-聚谷氨酸。沉淀物用水溶解除去不溶物，透析去除小分子物质，滤液冷冻干燥得白色粉末结晶。也可以用饱和CuSO₄，(NH₄)₂SO₄，NaCl沉淀γ-聚谷氨酸。