[发明专利]核酸靶分子选择及扩增方法

说明书

本发明涉及一种核酸靶分子选择及扩增方法。

遗传诊断或分子检测的基本方法是测定核酸序列的碱基组成或变化。核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，核酸的基本单位是核苷酸，它们通过磷酸二脂键连成链状结构，核苷酸的特征决定于其碱基，DNA中的四种碱基由A、C、G、T表示，RNA中的四种碱基为A、C、G、U。核酸中的碱基A与T(或U)配对(互补)，G与C配对(互补)，因为它们之间能形成稳定的氢键结构。有连续配对碱基的两条核酸链能结合(杂交)成双链结构，双链核酸结构在高温(90℃-100℃)下会分裂(变性)成单链核酸分子。核酸中的自然产碱基或核苷酸可被非自然产的类碱基或非自然核苷酸取代。非自然核苷酸包括双脱氧核苷酸(ddNTP)、双环核苷酸(LNA)、生物素标记脱氧核苷酸(Biotin-dNTP)、荧光素标记的双脱氧核苷酸(F-ddNTP)及不具核苷酸结构特征的分子链，含有由非典型磷酸二酯键组成的核酸包括肽键核酸(PNA)和硫代磷脂键脱氧核糖核酸(S-DNA)。含有非自然类碱基或类核苷酸的核酸可具有荧光性、高稳定性、抗酶降解性，并能终止聚合酶反应等。对核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)进行分子检测时，需把核酸样品中的靶分子筛选出来并加以扩增(复制出多个同一分子)。靶分子是须检测的核酸片段，其结构特征可以代表所属生物体的遗传特征。靶分子可以是DNA、RNA或是在体外由RNA转录成的DNA。筛选扩增得到高纯度的大量的靶分子后，用分子生物学技术可以测定靶分子的结构特征，从而得知生物体(病人)的遗传特征。目前，对核酸中的靶分子进行选择和扩增采用聚合酶链反应(PCR)。对一个双链DNA靶分子进行聚合酶链反应时，要有二个对靶分子具专一性的、方向相反的单链核酸小分子，即引物。引物是由化学方法合成的单链的DNA分子，能与靶分子在末端进行分子杂交，其长度为10-50碱基。一个引物与靶分子中的一条分子链在3′末端进行杂交，并在聚合酶的作用下有选择性地复制靶分子，反复此过程可得到大量的靶分子。现已经知道，造成一种遗传病的基因位点变化可以是不止一个，也就是说要检测一种或多种遗传病时，所需选择和扩增的靶分子种数可达数百以上。所述的基因位点是指核酸结构中特定的碱基位置或具多态性的碱基位置。基因是核酸功能性的划分或具一定功能的核酸片段，具一定的结构特征。进行分子检测时，如用常规的PCR方法，需要合成大量的引物，并用大量的反应分别对靶分子进行选择和扩增。这种做法所需要的人力物力、费用都很大。如把多个引物组合在一个PCR反应中，这些引物之间的相互作用会产生副产物，因而影响靶分子的筛选和扩增。另一种分子扩增的方法是使双链的DNA分子与启动子连接，然后用核糖核酸聚合酶把DNA转录成单链的核糖核酸(RNA)。用转录的方法可以把DNA分子平衡扩增成大量的RNA分子，同时可对RNA进行分子内标记，但转录方法的扩增能力一般在数百倍左右，因此单用转录的方法也难以把极微量的核酸扩增至可用的量。从生物体中提取的DNA分子一般为双链的大分子结构，由数千个以上的碱基单位组成。用物理方法如超声波或生物化学方法如限制性内切酶，脱氧核糖核酸酶可使DNA降解为短小的分子片段，这一由大分子转化为多个小分子的过程叫片段化。在适当的条件下连接酶可把多个DNA片段连接在一起达到末端延伸的目的，DNA分子片段也可在末端转移酶的作用下使3′末端延伸，DNA聚合酶也可利用DNA链作为模板对与其杂交的分子链进行3′末端的延伸，此外DNA外切酶还可以除去部分DNA分子序列，因此末端修饰包括末端切除和末端延伸。用聚合酶对专一引物进行单碱基延伸是分析多态性的常用方法，经末端修饰后可用数量较少的引物对多个靶分子进行PCR扩增，但这种扩增缺少选择性，现已知可用与靶分子互补的核酸分子即选择分子进行杂交，把杂交分子选出，然后进行扩增，这样可达到选择的效果，但常用的选择分子往往与靶分子形成双链结构，这不利多态性靶分子的选择，此外选择分子本身也易被扩增，可能造成假阳性反应。

本发明的目的是提供一种对多个不同的核酸靶分子进行选择和扩增的方法，它能克服现有技术的上述缺点。

一种核酸靶分子选择和扩增的方法，包括使靶分子片段化并与选择分子杂交，再对靶分子进行末端修饰和扩增，其特征是选择分子具有非自然核苷酸单位，在选择分子与靶分子形成的杂交序列中有部分单链结构。