[发明专利]乙型肝炎病毒耐药检测寡核苷酸基因芯片的制备和用途

说明书

乙型肝炎病毒(HBV)是一种严重危害人类健康和生命的病毒性传染病。目前虽有预防用的HBV疫苗，但全球近亿HBV感染者的治疗是医学界面临的一个难题(Zoulim F.et al.AntiviralRes.1999，44：1-30)。除了干扰素可选用外，最近发现治疗HIV的核苷类药物拉米呋啶(Lamivudine)对HBV具有很强的抑制作用，并很快开发为治疗HBV慢性感染病人的药物，投入临床应用。随着拉米呋啶在临床上的广泛应用，发现易出现拉米呋啶抗性现象，给HBV治疗带来影响。最近研究发现，拉米呋啶作用于HBV的靶蛋白——HBV多聚酶基因的点突变与HBV的拉米呋啶抗性密切相关，并发现了这些与HBV拉米呋啶抗性相关的点突变(Zoulim F，etal.J.Hepatology，1998，29：151-168)。HBV拉米呋啶抗性的快速检测对临床药物的合理应用，选择最佳治疗方案以及降低病人治疗费用等具有重要意义。

寡核苷酸基因芯片(Oligochip)是近年来发展成熟的一种高通量基因检测技术(Hacia J.Naturegenetics(Supl)，1999，21(1)：42-47)。寡核苷酸基因芯片的一个主要用途是基因突变的快速和高通量检测，已成功应用于HIVRT基因，结核杆菌利福平(Rifapin)抗性相关基因，肿瘤p53基因以及药物代谢相关细胞色素酶p450基因等的突变分析，是一种发展前景好的基因突变大规模检测新生物技术。

本发明的目的是，设计一种HBV耐药检测的寡核苷酸基因芯片，为建立合理高效的HBV治疗方案，指导临床合理用药提供快速高效的检测手段。

本发明的主要内容是：1、HBV耐药检测寡核苷酸芯片制备  根据HBV拉米呋啶抗药性相关突变主要位于HBV多聚酶基因的L526、A546、M550和V553等氨基酸位点，设计了28条寡核苷酸探针(见表1)。探针对应序列为HBV DNA聚合酶基因反义链，长度为15-18nt。设计探针时使其Tm值尽可能接近，但优先考虑探针长度，即探针长度位于15-18nt，以17为主。探针合成时在其3’端接氨基和间隔臂(spacer)等特定修饰，一方面利于探针与载玻片表面的活性醛基发生反应并固定到载体表面，同时增加固定于载体表面探针的自由度和与靶序列的可接近性(accessibility)。探针纯化与定量后，用基因芯片点样仪点到醛基修饰载玻片上，制成HBV耐药寡核苷酸芯片。芯片上每个探针重复2次，以验证检测结果的重复性。芯片上探针微阵列(microarray)中第1，5列探针对应HBV DNA野生型序列；其他探针对应于各种可能的突变型DNA序列。微阵列中

                                  表1

            氨基酸编号                            探针序列(5’→3’)        长度       Tm       GC％       分子量