[发明专利]一种将外源基因转入灵芝的方法

说明书

本发明涉及一种通过化学诱导将外源基因转入灵芝的方法，尤其是涉及一种利用聚乙二醇-氯化钙转化缓冲液(PTC)将外源基因高效转入灵芝的方法。

灵芝是一种珍贵的药用和食用菌，由于对多种疾病尤其是当今医学上的一些顽症如肝炎、心血管疾病、癌症等具有显著的疗效，因而已引起了国际医学界的瞩目。中国、日本、韩国、英国、美国已广泛开展了灵芝的生化、药理、临床等方面的研究。但是关于灵芝的分子生物学方面的研究，目前很少见报道，迄今尚未有外源基因转入灵芝中的报道。为了进行灵芝的分子生物学研究，建立一个高效的转化系统是必需的，也是利用现代基因工程定向改良灵芝的药用品质的前提。此外，灵芝是一种对人体无任何毒副作用的大型药用和食用真菌，以它作为外源基因的受体菌，对人体安全可靠，具有与细菌、酵母菌等不同的独特优点，它是一种应用前景很广的异源基因表达系统。因此，通过基因工程技术建立稳定、高效的灵芝转化系统，对充分利用和开发灵芝这一珍贵的资源有着重要的意义。

本发明的目的在于提供一种利用PTC转化缓冲液将外源基因高效转入灵芝的方法，以便建立稳定、高效的灵芝外源基因转化体系，从而能够直接有效地获得具有优良遗传性状或重要经济价值的表达产物的转基因灵芝新菌种。

本发明的目的是通过以下技术措施实现的：用溶壁酶将灵芝菌丝体酶解成原生质体，所制备的原生质体经精制、纯化后，利用PTC转化缓冲液，以纯化的灵芝原生质体作为受体细胞，将含有外源基因的真菌表达载体转入灵芝原生质体中，再将转化后的灵芝原生质体进行再生培养和选择性培养，从而获得灵芝转化株。本方法的转化效率可达60-100个转化子/μgDNA.10⁷转化子。

本发明包括以下具体步骤：

(1)灵芝原生质体的制备：用PDA液体培养基26-28℃，120-180rpm培养从斜面接种的灵芝菌丝体3天，然后用接种刀剧烈搅拌菌丝3分钟；接种3mL菌丝悬液到100mL MYG液体再生培养基中，160-200rpm摇床培养3天；用由1-5g溶壁酶溶解于100mL0.1-1.0mol/L的渗透压稳定剂溶液而成的溶壁酶液，按每300mg灵芝菌丝体加1mL溶壁酶液计算，在30℃、pH值为6.0条件下酶解3-4小时；将所得原生质体用灭菌的八层纱布过滤纯化后，5000g离心5分钟，0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂洗涤一次，然后用15mL STC洗涤一次，最后溶于1mL STC中；血球计数板计数，然后稀释到10⁸个/mL，4℃保存备用；

(2)原生质体转化：取160μl灵芝原生质体(约2×10⁷个)，加入30-70μL PTC转化缓冲液，再加入10-50μL真菌表达载体、浓度为10-100mmol/L的ATA 10-100μL和浓度为10-100mmol/L亚精胺5-50μL，充分混匀后，冰浴45分钟；然后加入1-2mL STC缓冲液，室温静置25分钟；4℃8000g离心5分钟，然后用500μL STC重悬后于4℃、5000g离心5分钟，再用1-2mL STC重新溶解原生质体沉淀，26-28℃放置18-24小时后，取100μL涂于含有100μg/mL HmB的MYG固体再生培养基平板；一般2-3个星期后，转化子长出。

本发明中所述的真菌表达载体通常为含有外源目的基因的pAN7-1真菌表达质粒；该质粒所带的大肠杆菌hph基因上游和下游分别与构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)启动子和色氨酸合成酶C基因(trpC)转录终止序列连接而能在真菌中表达。

本发明中所述的MYG液体再生培养基为：麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L；再在该MYG液体培养基中加入15克的琼脂，即得MYG固体再生培养基。

本发明中所述的渗透压稳定剂为硫酸镁、葡萄糖或甘露醇。

本发明中所述的PTC缓冲液由浓度为10-80％(w/v)的PEG4000，浓度为1-10mmol/L的CaCl₂，浓度为1-10mmol/L的Tris混合而成。

在本发明中所述的STC缓冲液由浓度为0.1-0.8mol/L的山梨醇，浓度为的10-100mmol/L Tris.Cl，浓度为10-100mmol/L的CaCl₂混合而成。