[发明专利]人透明带B细胞表位融合肽及其生产方法

说明书

本发明涉及生物化学领域，特别是人透明带B细胞表位融合肽，本发明还涉及该融合肽的生产方法。

透明带是精卵识别和结合的基础，利用抗透明带抗体可以阻止精卵结合，透明带疫苗能抑制受精，在受孕前避孕。

天然的人透明带来源于育龄妇女的卵泡组织，可想而知，取材特别困难；

用基因重组的人透明带作抗原进行主动免疫会引起自身免疫卵巢炎等副作用；van Duin等(1994)用CHO细胞表达的人透明带(rhZP3)，但Paterson等(1998)用rhZP3免疫猕猴，初次免疫产生1/10000的抗体滴度，但rhZP3引起的免疫反应也引起卵巢炎，卵泡发生抑制。这是由于透明带引起的T细胞免疫导致的自身免疫反应所致。

发明人曾经设计了由人透明带精子受体相关的B细胞表位和外源辅助T细胞表位串联而成的嵌合肽，该嵌合肽可诱发抗体而不引起自身免疫反应。但由于该嵌合肽分子量小，通过基因工程方法表达以后与宿主细胞自分泌蛋白混在一起，不易鉴定和纯化，特别是在大规模生产时增加生产成本。

原来的人透明带B细胞表位嵌合肽由外源辅助T细胞表位14肽和人透明带ZP3的334-360位的27肽串联组成的41肽。Pro Ser  Asp  Lys  His Ile Glu Gln  Tyr  Leu  Lys  Lys Lys  Ala  ArgArg  Gln  Pro  His  Val  Met  Ser Gln   Try  Ser Arg   Ser  Ala  SerArg  Ash  Arg  Arg  His  Val Thr  Glu  Glu Ala Asp  Val

多肽链的分子量约为4.5kD，如果计算一定的O-糖链，分子量可达5-7kD。

当用基因工程方法表达生产这一短肽时，用常规的方法不易分离纯化该短肽，特别是细胞培养液中往往含有其它的培养液蛋白和细胞自分泌蛋白等多种成分，一般要经过离子交换和凝胶过滤才能把该表达产物分离开来。而且，由于该表达产物分子量很小，需要选用适合小分子量的填料进行凝胶过滤才能有效地分离。

本发明目的在于针对现有技术存在的缺陷，设计一种人透明带B细胞表位融合肽，在尽量不改变原嵌合肽的结构和功能的前提下对该嵌合肽进行小的分子修饰，使其基因表达产物能方便地鉴定和分离。

本发明的目的还在于提供该融合肽的生产方法。

本发明的人透明带B细胞表位融合肽由两段肽段串联而成，一个肽段含人透明带B细胞表位嵌合肽41肽序列，另一肽段是含有6个组氨酸表位的短肽，将它串联在嵌合肽的C末端或N末端作特征性标记，既可保留原肽段的功能，又便于该融合肽的鉴定和分离。

如果把该组氨酸表位的短肽串联在原嵌合肽的两端，则不会影响原嵌合肽的结构和功能。分离后不必酶解去除6组氨酸短肽，直接使用可保留原嵌合肽的功能活性。

本发明的人透明带B细胞表位融合肽可以用以下方式表达：

1、在含人透明带(ZP3)B细胞表位嵌合肽41肽序列肽段的C末端串联一段含有6个组氨酸表位的短肽作特征性标记：

2、在含人透明带(ZP3)B细胞表位嵌合肽41肽序列肽段的N末端串联一段含有6个组氨酸表位的短肽作特征性标记：其中，表示含有6个组氨酸表位的短肽；表示含人透明带(ZP3)的B细胞表位嵌合肽的肽段。人透明带(ZP3)的B细胞表位嵌合肽(41肽)序列如下：

Pro Ser  Asp  Lys  His Ile  Glu  Gln Tyr  Leu  Lys   Lys Lys AlaArg  Arg  Gln  Pro  His  Val  Met  Ser  Gln  Try  Ser  Arg  Ser AlaSer  Arg  Asn  Arg  Arg  His  Val Thr  Glu  Glu Ala Asp  Val

串联一段含6个组氨酸的短肽后，则可利用该肽的抗体进行鉴定和分离。

现有商品化的分离纯化柱，可通过一步纯化法回收表达产物的融合蛋白。

本发明的人透明带B细胞表位融合肽生产方法是采用基因工程方法生产该融合肽。

基因工程方法处理后得到的培养液离心取上清，透析，浓缩，过柱；用平衡缓冲液洗柱，匀速加样，之后加入平衡缓冲液，再用洗脱缓冲液洗脱分离的样品，收集各个组分分析鉴定。

回收的融合肽经透析，浓缩后保存备用。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、本发明的人ZP3精子受体相关的B细胞表位融合肽可用于免疫抑制受精的表位抗原，可作为抗原用于发展避孕疫苗阻止受精。是透明带避孕疫苗的新突破。