[发明专利]冰核活性基因、表达载体和工程菌

说明书

本发明的技术领域：

本发明属于生物防治技术领域。进一步，本发明涉及冰核活性基因、其克隆方法、表达载体和工程菌。更进一步，本发明涉及冰核基因序列、冰核活性蛋白的氨基酸序列，冰核基因多宿主转移和染色体整合的表达载体mob-Tn5-iceA。

本发明的研究背景：

一些细菌能产生在-5℃以上具催化活性的冰核，这些细菌被称为冰核细菌。据报道，细菌中的20多个种或变种可产生自然界活性最强的异质冰核；冰核细菌的冰核活性是由冰核活性基因决定的。克隆的细菌冰核蛋白基因，可在环境安全(environmentally safe)或遗传安全(genetically regarded as safe)菌株中高效表达，可用于细菌细胞表面展示、高敏检测和作报道基因，显示良好应用前景。冰核细菌和冰核基因表达的冰核蛋白可在较高温度(-1～-5℃)下催化水结冰，可以应用在促冻杀虫、人工造雪、制冰、食品的冷冻浓缩、冷冻干燥和质地加工等方面。

自Orser(Orser，C.等，J.Bacteriol.，1985，164：359-366)从Erwinia herbicola中克隆到第一个冰核基因iceE以来，已先后有7个细菌冰核基因先后得到克隆和测序。细菌冰核基因克隆通常采取两种方案，早期的Orser等人(Orser，C.等，J.Bacteriol.，1985，164:359-366)构建了P.syringae和E.herbicola的基因文库，并用复制冻结技术(replica freezing technique)直接筛选冰核活性阳性克隆。细菌冰核基因的另一种克隆途径是利用同源冰核基因片段制备探针，从基因组文库中钓取目标基因，如Michigami等(Michigami，Y.等，Biosci.Biotech.Biochem.，1994，58：763-764)从E.uredovora KUIN-3中分离到一个新的冰核基因inaU。目前，还无人利用PCR的方法克隆到冰核活性基因，也没有把冰核活性基因整合到染色体DNA上的转基因工程菌。

因此，用PCR的方法获得冰核基因，并把冰核基因整合到染色体DNA上获得转基因促冻杀虫基因工程菌，就具有很强的实用性。

本发明的内容：

本发明的目的：

我国“三北”地区重要农林果树害虫包括有玉米螟、棉铃虫、草地螟、大豆食心虫、松毛虫、光肩星天牛等二十几种，此外还有仓储害虫，它们经常造成巨大的经济损失。在人们意识到单纯化学防治所带来的种种弊端后，生物防治措施才得以重视。这些害虫在冷冬季节越冬死亡率高、暖冬季节死亡率低，而越冬死亡率高低是决定翌年危害程度的重要因素，压低越冬虫源基数是控制害虫发生的有效措施。冰核细菌促冻杀虫理论已确凿无疑，但却难以应用现有的这些野生型冰核细菌来冻杀田间和仓储越冬害虫，主要原因有两个：其一，目前用于促冻杀虫研究的冰核细菌在昆虫肠道内不能稳定定殖，田间施用后易被虫体排出体外而失去冻杀效果；其二，这些冰核细菌在植物体上附生定殖能力强，田间施用后易诱发霜冻。这两方面原因已成为阻碍促冻杀虫应用中的世界性难题。

本发明利用PCR方法获得细菌冰核基因，然后利用该基因构建一种mob-Tn5-iceA表达载体；进一步，利用该载体和适合的宿主菌构建了适于冻杀田间越冬害虫和仓储害虫的促冻杀虫基因工程菌，并完成对玉米螟和棉铃虫冻杀效果的测试工作。

本发明的技术方案：

1.菠萝欧文氏菌110菌株中iceA基因的克隆

参照《精编分子生物学实验指南》商法提取菠萝欧文氏菌(Erwiniaananas)110的染色体DNA，电泳检测(图1)。以菠萝欧文氏菌110染色体DNA为模板，用高保真DNA Taq plusI DNA多聚酶进行PCR扩增冰核基因。实验参照《现代分子生物学实验技术》进行。所用引物如下：

引物1(+)(正向引物)：5’CCCTAATGAAATTTTAGACATG3’27bp

引物1(-)(反向引物)：5’CCTCTGTTATGGCGATTATTCTTCGGG3’27bp